貴州省余慶縣茶褐枯病病原菌的鑒定

王雪 王勇 尹橋秀

摘要 為鑒定引起茶褐枯病的病原菌，本研究對病原菌進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)，通過柯赫氏法則驗(yàn)證菌株的致病性，并觀察病原菌的形態(tài)特征，依據(jù)病原菌rDNA-ITS、ACT、CAL 和TUB2基因進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示：病原菌分生孢子呈淡藍(lán)色，表面光滑，無隔膜，圓柱狀，兩端鈍或向底部變窄，水滴狀斑點(diǎn)，大小為（11.7～29.5）μm×（3.9～7.7）μm，平均為（19.4±4.4）μm×（5.4±0.8）μm，分生孢子梗形成于氣生菌絲上，透明，具有隔膜;附著胞為棒狀等不規(guī)則形狀，顏色呈棕色到深棕色，單生。基于病原菌形態(tài)學(xué)鑒定和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將病原菌確定為山茶刺盤孢Colletotrichum camelliae。

關(guān)鍵詞 茶褐枯病; 山茶刺盤孢; 形態(tài)特征; 致病性分析; 系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)： S 435.711 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019225

Abstract To identify the pathogen causing tea brown blight disease， we isolated， purified and cultivated the pathogenic fungus from the diseased tea leaves. Its pathogenicity was determined according to Kochs rule， and the morphological characteristics of the pathogen were observed. Phylogenetic analysis of multi-locus sequences， including rDNA-ITS， actin， calmodulin and tubulin 2， was conducted. The results showed that the conidium of the pathogen was hyaline， smooth-walled， aseptate， cylindrical， with obtuse ends or narrowed towards the base， guttulate， （11.7-29.5）μm×（ 3.9-7.7）μm， and the average was （19.4±4.4）μm×（5.4±0.8）μm. Conidiophores were directly formed from aerial mycelia， hyaline， septate. Appressoria were clavate， irregularly shaped， brown to dark brown， and solitary. Based on phylogenetic analyses and morphology， the pathogen was identified as Colletotrichum camelliae.

Key words tea brown blight disease; Colletotrichum camelliae; morphological characteristics; pathogenicity analysis; phylogenetic analysis

茶樹是多年生灌木或喬木，廣泛種植于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)。茶樹病害種類較多，對茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成一定的影響[1-3]。據(jù)報(bào)道，世界上已有記載的茶樹病原種類多達(dá)500余種，我國已記載的茶樹病害種類有138種[2]。根據(jù)病害在茶樹上的發(fā)生部位，將其分為葉部病害、莖部病害、根部病害和花部病害。其中，茶樹葉部病害的種類相對其他部位的種類多[2]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，同一種病原菌可侵染茶樹不同的組織部位，引起不同的組織產(chǎn)生病害[4-7]。此外，多種病原菌可復(fù)合侵染引起茶樹病害[8]。2016年至今，陸續(xù)有茶樹新病害和新病原的報(bào)道，例如，擬盤多毛孢Pestalotiopsis camelliae所引起的茶輪斑病[9]，茶擬盤多毛孢P. theae引起的黑褐色葉斑病[10]，莖點(diǎn)霉屬病原菌Phoma segeticola var. camelliae和P. herbarum所引起的茶葉斑病[11-12]，果生刺盤孢Colletotrichum fructicola 所引起的茶炭疽病[13]。茶褐枯病（tea brown blight disease）是由病原真菌所引起的茶樹葉部病害，該病害在中國、日本、斯里蘭卡、印度等產(chǎn)茶國家均有報(bào)道[14-18]。病害發(fā)生初期，病斑呈深褐色，圓形;后期病斑逐漸擴(kuò)大形成不規(guī)則病斑，中央出現(xiàn)凸起的黑色塊狀物質(zhì)，四周褪色，邊界清晰[14]。發(fā)生茶褐枯病的茶樹樹勢衰退，茶樹抽發(fā)的新梢、新芽較少，茶葉產(chǎn)量顯著降低[14]。引起茶褐枯病的病原菌有多種，例如，山茶刺盤孢C.camelliae[19-20]、圍小叢殼菌山茶專化型Glomerella cingulata f.sp. camelliae和葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea可通過復(fù)合侵染引起茶褐枯病[8]等。此外，文獻(xiàn)報(bào)道C.acutatum的復(fù)合體和C.gloeosporioides的復(fù)合體也可導(dǎo)致茶褐枯病[14-15， 19]。山茶刺盤孢是最早被鑒定為茶褐枯病的病原菌[20]。同時(shí)，山茶刺盤孢也是茶炭疽病的病原菌之一[21]。因培養(yǎng)條件的不同，山茶刺盤孢在菌落形態(tài)、孢子大小、長寬比等方面存在一定的差異[7， 19， 21-22]。采用多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的方法是鑒定山茶刺盤孢的主要依據(jù)，例如，rDNA-ITS、TUB2、ACT和CAL基因[20]。

貴州省是我國最大的茶葉產(chǎn)區(qū)，截至2017年底，全省投產(chǎn)茶園面積穩(wěn)定在35萬hm2 以上[23]。由于貴州茶區(qū)存在多云霧、寡日照、早春低溫陰雨等氣候特征，茶樹病害的發(fā)生率、危害度較其他茶區(qū)嚴(yán)重，成為限制貴州省茶產(chǎn)葉產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素[11， 23-25]。2016年5-8月，本課題組在貴州省余慶縣二龍茶區(qū)進(jìn)行田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一種茶樹葉部病害，個(gè)別茶園病害發(fā)生率達(dá)35%至48%，病害嚴(yán)重度在32%至43%，其病害特征與茶褐枯病癥狀相似（圖1）。為了明確該病的病原菌，本文對該病害的病原菌進(jìn)行分離、純化、形態(tài)學(xué)觀察、多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析，以及致病性試驗(yàn)，確定引起該地區(qū)茶樹葉部病害的病原為山茶刺盤孢。本研究為該病害的防控提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離、培養(yǎng)和純化

2016年5月-8月，在貴州省余慶縣二龍茶區(qū)采集具有典型茶褐枯病癥狀的茶樹葉片，參照本課題組前期研究方法，將分離好的組織葉片置于25℃培養(yǎng)箱中的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose ager，PDA）上[11， 24]。培養(yǎng)3～4 d后挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化，得到3個(gè)形態(tài)相似的代表性菌株，將其保存于本實(shí)驗(yàn)室的農(nóng)作物病害標(biāo)本室。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中7 d，挑取PDA培養(yǎng)基上少許菌絲制片，采用光學(xué)顯微鏡（Olympus， BX43和FVMPE-RS）和掃描電鏡（Hitachi， S-3400N）觀察病原菌的菌落、菌絲、分生孢子梗、分生孢子及附著胞的形態(tài)特征，并記錄大小。

1.3 致病性測試

挑取在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后的菌碟（d=4 mm）接種至經(jīng)針刺和剪切處理后的茶葉片、莖及花上，采用濕潤的無菌脫脂棉進(jìn)行48 h保濕[11， 24， 26]。套上保鮮袋，置于25℃人工氣候箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。同時(shí)接種無菌PDA的葉片、莖及茶花作為空白對照。48 h后取下脫脂棉及菌碟，并定期觀察及記錄癥狀變化。每個(gè)處理方式均15個(gè)重復(fù)。對發(fā)病部位進(jìn)行再分離，確定其與接種菌株是否一致。上述試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 分子鑒定

根據(jù)Weir等[20]報(bào)道的引物，對核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)（rDNA-ITS）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、鈣調(diào)蛋白（CAL）、微管蛋白（TUB2）基因進(jìn)行擴(kuò)增及測序，其中，CAL采用CL1和CL2A引物進(jìn)行擴(kuò)增，TUB2 采用T1和Bt-2b引物進(jìn)行擴(kuò)增。基因序列采用NCBI-BLAST在線比對，其結(jié)果用以確定屬級(jí)分類地位。測序結(jié)果上傳GenBank獲取登錄號(hào)，并下載相關(guān)的參比序列。采用PAUP v 4.0b10（Swofford 2003）及最大簡約法（maximum parsimony， MP）進(jìn)行聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建，rDNA-ITS、TUB2、ACT和CAL基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法選擇Bootstrap，重復(fù)次數(shù)（replication）為1 000，最大的樹數(shù)目（maxtree）設(shè)置為5 000。小于50的自展值在發(fā)育樹上不體現(xiàn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用ANOVA （LSD）對各組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用順序字母標(biāo)注法進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與純化

從有典型茶褐枯病癥狀的茶樹葉片分離純化出15個(gè)菌株，其中山茶刺盤孢 C.camelliae菌株最多，共10個(gè)，比例約為66.7%，同時(shí)也分離到枝狀枝孢Cladosporium cladosporioides、荸薺莖點(diǎn)霉稈枯病菌Didymella bellidis、雙乳突炭層菌Nemania bipapillata和棕櫚擬盤多毛孢Pestalotiopsis trachicarpicola等菌株。選擇GZYQ-2016-01 等3個(gè)代表性菌株進(jìn)行深入研究。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

GZYQ-2016-01菌株在PDA培養(yǎng)基上為白色菌絲，邊緣氣生狀，中間絨毛狀，邊緣平整。培養(yǎng)8 d后，菌落中央顏色加深，變?yōu)榛液稚Ｓ^察發(fā)現(xiàn)，分生孢子梗形成于氣生菌絲上，透明，具有隔膜（圖2a～c）;分生孢子梗頂端產(chǎn)生分生孢子，隨著分生孢子的成熟和變大，分生孢子與分生孢子梗分離（圖2c），并在分生孢子梗末端形成斷面和缺口（圖中箭頭所示）（圖2d～e）。鏡下未觀察到厚垣孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞及有性型。孢子呈淡藍(lán)色，表面光滑，無隔膜，圓柱狀，兩端鈍或向底部變窄，水滴狀斑點(diǎn)，大小為（11.7～29.5）μm×（3.9～7.7）μm，平均為（19.4±4.4）μm×（5.4±0.8）μm，長寬比=3.6，n=50，鏡下未觀察到剛毛（圖3a～b）。附著胞為棒狀等不規(guī)則形狀，顏色呈棕色到深棕色，單生，大小為（11.9～25.1）μm×（5.6～16.4）μm，平均為（15.6±2.4）μm×（10.0±2.7）μm，長寬比=1.56，n=50（圖中箭頭所示）（圖3c～d）。

2.3 病原菌的致病性測定

茶樹葉片采用剪切法和針刺法，嫩莖采用剪切法，茶花花瓣采用針刺法接種無菌PDA或菌株GZYQ-2016-01，并定時(shí)觀察和記錄癥狀。接種無菌PDA未導(dǎo)致葉、莖和花產(chǎn)生病斑（圖4a～d）。接種病原菌至葉、莖和花2 d后，均可見較為明顯的病斑，其中，葉片傷口處呈褐色，邊緣為黑色。當(dāng)時(shí)間延長至10 d，2種處理的葉部病斑都不斷擴(kuò)大（圖4e～f）。接種病原菌10 d后，莖部病斑不斷擴(kuò)大，呈黑褐色（圖4g），上位葉萎蔫（圖片未顯示）。接種病原菌4 d，花瓣接種處變?yōu)榛液稚ò晡瑁▓D4h）。其中，葉部癥狀與田間癥狀相似。進(jìn)一步對病斑中的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及分子鑒定，結(jié)果表明與接種菌一致。進(jìn)一步對茶葉針刺和剪切處理10 d的發(fā)病率和病斑大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，表明剪切處理的侵染率與針刺處理相同（P<0.05），并且2種處理在接種后期的病斑大小差異不明顯（P<0.05）（表1）。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

在獲得菌株GZYQ-2016-01的rDNA-ITS（MK058490）、CAL（MK078541）、TUB2 （MK192296）、ACT（MK078543）等基因登錄號(hào)后，序列比對發(fā)現(xiàn)菌株GZYQ-2016-01與C.camellia的模式菌株（LF152）的4個(gè)基因序列相似性非常高。我們采用4個(gè)基因（rDNA-ITS+TUB2+CAL+ACT）加合的方法進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析。4個(gè)基因加合總長度為2 305個(gè)位點(diǎn)（ACT：1-282， rDNA-ITS： 283-876， TUB2： 877-1 571， CAL： 1 572-2 305）。其中，簡約信息位點(diǎn)20個(gè)，可變非簡約信息位點(diǎn)72個(gè)，并采用PAUP v 4.0b10（Swofford 2003）軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。運(yùn)行結(jié)果顯示獲得1個(gè)進(jìn)化樹（TL=105， CI=0.93， RI=0.85， RC=0.80， HI=0.07）（圖5）。系統(tǒng)學(xué)的分析將GZYQ-2016-01與模式菌株C.camelliae LF152歸為一個(gè)分支（自舉支持率為96%）。

[9] CHEN Yingjuan， ZENG Liang， SHU Na， et al. First report of Pestalotiopsis camelliae causing grey blight disease on Camellia sinensis in China [J]. Plant Disease， 2017， 101（6）： 1034.

[10] WANG Zhenhua， ZHAO Zixi， HONG Ni， et al. Characterization of causal agents of a novel disease inducing brown-black spots on tender tea leaves in China [J]. Plant Disease， 2017， 101（10）： 1802-1811.

[11] 趙曉珍， 王勇， 李冬雪， 等. 茶樹新病害病原菌Phoma segeticola var. camelliae的形態(tài)學(xué)及系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2018， 39（9）： 556-559.

[12] KUBERAN T， DENG Cheng， CHENG Linlin， et al. Report of Phoma herbarum causing leaf spot disease of Camellia sinensis in China [J]. Plant Disease， 2018， 102（11）： 2373.

[13] SHI Niuniu， DU Yixin， RUAN Hongchun， et al. First report of Colletotrichum fructicola causing anthracnose on Camellia sinensis in Guangdong province， China[J]. Plant Disease， 2017， 102（1）： 241.

[14] CHEN Yingjuan， TONG Huarong， WEI Xu， et al. First report of brown blight disease on Camellia sinensis caused by Colletotrichum acutatum in China[J]. Plant Disease， 2015， 100（1）： 227.

[15] GUO Min， PAN Yuemin， DAI Yuli， et al. First report of brown blight disease caused by Colletotrichum gloeosporioides on Camellia sinensis in Anhui province， China[J]. Plant Disease， 2014， 98（2）： 284.

[16] CHEN Yingjuan， QIAO Wenjun， ZENG Liang， et al. Characterization， pathogenicity， and phylogenetic analyses of Colletotrichum species associated with brown blight disease on Camellia sinensis in China [J].Plant Disease，2017，101（6）：1022-1028.

[17] CHAKRABORTY U， DAS R， BASU P， et al. Serological cross reactivity between Glomerella cingulata by Camellia sinensis [J]. Indian Phytopathology， 2002， 55（1）： 1-7.

[18] WILLIS J C. Bulletin of miscellaneous information （Royal Botanic Gardens， Kew） [M]. London： Nabu Press， 1899： 89-94.

[19] LIU F， WEIR B S， DAMM U， et al. Unravelling Colletotrichum species associated with Camellia： employing ApMat and GS loci to resolve species in the C. gloeosporioides complex [J]. Persoonia， 2016， 35（1）： 63-86.

[20] WEIR B S， JOHNSTON P R， DAMM U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex [J/OL]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 115-180.

[21] WANG Yuchun， HAO Xinyuan， WANG Lu， et al. Diverse Colletotrichum species cause anthracnose of tea plants （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） in China [J/OL]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 35287.

[22] SHARMA G， PINNAKA A K， SHENOY B D. Resolving the Colletotrichum siamense species complex using ApMat marker[J]. Fungal Diversity， 2015， 71（1）： 247-264.

[23] 陳松，任亞峰，李冬雪，等.貴州茶樹病害可持續(xù)控制的研究與應(yīng)用路徑探索[J].中國植保導(dǎo)刊，2018，38（10）：85-90.

[24] 李冬雪， 趙曉珍， 王勇， 等. 貴州惠水縣茶輪斑病病原菌的鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018， 39（9）： 1827-1833.

[25] LI Dongxue， BAO Xingtao， REN Yafeng， et al. First report of Lasiodiplodia theobromae causing leaf spot on tea plant in Guizhou province of China [J]. Plant Disease， 2018，103（2）： 374.

[26] 方中達(dá).植物研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：46-50.

[27] CAI Liu， HYDE K D， TAYLOR P W J， et al. A polyphasic approach for studying Colletotrichum[J]. Fungal Diversity， 2009， 39（12）： 183-204.

（責(zé)任編輯： 田 喆）