長鏈非編碼RNA-HOTAIR在曲妥珠單抗耐藥細胞株中的表達變化研究

魏盤妹 朱靖 陳天文

【摘要】 目的：研究長鏈非編碼RNA-HOTAIR在曲妥珠單抗耐藥細胞株與曲妥珠單抗敏感細胞株中的表達差異。方法：選取乳腺癌細胞系SK-BR-3-TS，通過間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結合的方法，誘導建立曲妥珠單抗耐藥細胞系SK-BR-3-TR。qRT-PCR檢測SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細胞HOTAIR的表達情況。結果：在成功誘導及穩定培養乳腺癌曲妥珠單抗耐藥細胞系SK-BR-3-TR中，HOTAIR RNA表達水平（2.216±0.332），明顯高于曲妥珠單抗敏感細胞株SK-BR-3-TS的（0.326±0.050），差異有統計學意義（P=0.000 6）。結論：曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3-TR中HOTAIR表達明顯上調。

【關鍵詞】 乳腺癌 HOTAIR 曲妥珠單抗 耐藥 長鏈非編碼RNA

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.001 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）12-000-03

Study on the Expression Changes of Long Non-coding RNA-HOTAIR in Trastuzumab Resistant Cell Lines/WEI Panmei， ZHU Jing， CHEN Tianwen. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -3

[Abstract] Objective： To study the expression difference of long non-coding RNA-HOTAIR in trastuzumab resistant cell lines and trastuzumab sensitive cell lines. Method： The breast cancer cell line SK-BR-3-TS was selected and the trastuzumab resistant cell line SK-BR-3-TR was induced by the combination of intermittent large dose shock and gradually increasing dose. HOTAIR expression was detected in the SK-BR-3-TS and SK-BR-3-TR cell lines by qRT-PCR. Result： In the successful induction and stable culture of trastuzumab resistant breast cancer cell line SK-BR-3-TR， the expression level of HOTAIR RNA （2.216±0.332） was significantly higher than （0.326±0.050） of trastuzumab sensitive cell line SK-BR-3-TS， and the difference was statistically significant

（P=0.000 6）. Conclusion： The expression of HOTAIR is significantly up-regulated in trastuzumab resistant breast cancer cell lines SK-BR-3-TR.

[Key words] Breast cancer HOTAIR Trastuzumab Drug resistance Long non-coding RNA

First-authors address： Huazhong University of Science & Technology Union Shenzhen Hospital， Shenzhen 518000， China

HER2陽性分子亞型乳腺癌占所有乳腺癌的20%～25%，此亞型乳腺癌因具有高增殖能力、富侵襲性、易遠處轉移等生物學特征，患者預后較差[1]。曲妥珠單抗耐藥是HER2陽性乳腺癌治療失敗的重要因素之一，深入研究曲妥珠單抗耐藥機制，尋找潛在治療靶點，克服其耐藥是改善HER2陽性乳腺癌患者生存的重要途徑[2]。近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與惡性腫瘤的關系研究已成為腫瘤研究領域的熱點之一，與惡性腫瘤的發生發展及藥物抵抗有關[3]。同源異形盒轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是一種包含2 158個核苷酸的基因間長鏈非編碼RNA。研究表明，HOTAIR與乳腺癌的發生發展、腫瘤細胞的侵襲轉移及患者預后相關[4-5]。近些年來，有多項體外研究及回顧性臨床研究結果提示，HOTAIR與肺癌、宮頸癌、卵巢癌鉑類化療耐藥相關[6-8]。在乳腺癌中，一項研究提示，HOTAIR在多個ER陽性、他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞系及乳腺癌他莫昔芬治療失敗的復發轉移組織標本中均高表達[9]，進一步體外研究揭示，HOTAIR在雌激素剝奪的乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞株中仍然高表達，通過上調耐藥細胞ER受體表達參與他莫昔芬耐藥。然而，HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的相關研究目前未見報道，本研究旨在檢測曲妥珠單抗耐藥細胞株中HOTAIR的表達情況，從而為進一步研究HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的相關性機制提供初步理論基礎，現報道如下。

1 材料與方法

選取乳腺癌細胞系SK-BR-3-TS，通過間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結合的方法，誘導建立曲妥珠單抗耐藥細胞系SK-BR-3-TR。qRT-PCR檢測SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細胞HOTAIR的表達，MTT法檢測兩種細胞模型腫瘤細胞的增殖活性，具體如下。

1.1 SK-BR-3-TR細胞的制備及穩定培養

SK-BR-3細胞系來自美國ATCC公司，曲妥珠單抗（Trastazumab）來自中國上海羅氏制藥有限公司。采用間隙大劑量沖擊和逐步增加劑量相結合的方法，誘導建立曲妥珠單抗耐藥SK-BR-3-TR細胞模型，具體如下：（1）取處于對數生長期SK-BR-3-TS細胞，在完全培養基中加入0.5 μg/ml（約10倍的50%抑制濃度）曲妥珠單抗，直至細胞能在0.5 μg/ml曲妥珠單抗條件下穩定生長;（2）之后逐步增加藥物濃度，使細胞依次在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/ml曲妥珠單抗環境下穩定生長和傳代;（3）誘導細胞在8 μg/ml曲妥珠單抗環境下穩定生長和傳代1個月后，獲得SK-BR-3-TR細胞;（4）之后將SK-BR-3-TR細胞在含4.0 μg/ml完全培養基中培養。整個耐藥誘導時間約7個月。

1.2 SK-BR-3-TR細胞的鑒定

MTT法檢測不同濃度曲妥珠單抗干預下SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細胞增殖能力。（1）種板：取對數生長期SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細胞，胰酶消化，血清終止反應，離心去上清，完全培養液重懸細胞，血球計數板計算細胞數，以

3 000個/孔接種于96孔板;（2）加藥：培養24 h、細胞貼壁后去上清，加入含有曲妥珠單抗濃度藥物的完全培養基，200 μl/孔，其中藥物終濃度分別為0、2、4、6 μg/ml和8 μg/ml，其中0 μg/ml為對照組，不含細胞的完全培養基為調零孔，每組設6個復孔;（3）加入MTT：培養箱內培養24 h后，加入MTT工作液，20 μl/孔，其終濃度為5 μg/ml，培養箱內避光孵育4 h;（4）溶解：取出培養板，避光去上清，每孔加入150 μl DMSO，避光振蕩溶解5 min;（5）檢測：酶標儀中，490 nm波長處檢測吸光值;（6）分析：取每組吸光值平均值，繪制細胞活性曲線。細胞增殖率按照以下公式計算：增殖率（或者細胞活性）=（試驗組OD值-調零孔OD值）/（對照組OD值-調零孔OD值）。

按照Trizol Reagent說明書進行細胞總RNA的提取，對比RNA的變化。

1.3 統計學處理

本研究數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曲妥珠單抗耐藥細胞SK-BR-3-TR的成功誘導和穩定培養

在間歇大劑量沖擊過程中，首先誘導出能夠在較低濃度曲妥珠單抗下繁殖、穩定生長傳代的耐藥克隆;之后逐步增加曲妥珠單抗劑量，細胞再次經歷凋亡、耐藥克隆形成并生長過程，直至篩選出能在8 μg/ml曲妥珠單抗環境下穩定生長的細胞克隆，見圖1。

2.2 不同濃度曲妥珠單抗干預下SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR細胞活性檢測

MTT法檢測結果表明，不同濃度曲妥珠單抗作用24 h后，SK-BR-3-TS細胞增殖能力隨藥物濃度升高而逐漸降低，而SK-BR-3-TR細胞增殖活性隨藥物濃度升高未發生明顯變化。與對照組相比，4 μg/ml作用24 h后，SK-BR-3-TS活性降低接近40%（0.63±0.03），而SK-BR-3-TR細胞未發生顯著變化（0.94±0.05）;進一步升高度曲妥珠單抗濃度至8 μg/ml對SK-BR-3-TR細胞增殖活性仍無顯著影響（0.84±0.03），但SK-BR-3-TS活性進一步被降低（0.19±0.01），見圖2。

2.3 SK-BR-3-TR中HOTAIR的RNA表達水平明顯上調

在本試驗中發現，HOTAIR的表達水平在曲妥珠單抗敏感細胞株SK-BR-3-TS中較低（0.326±0.050），而在曲妥珠單抗耐藥細胞株SK-BR-3-TR中其表達量明顯上調（2.216±0.332），差異有統計學意義（P=0.000 6），見圖3。

3 討論

成功誘導及穩定培養曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞系，是開展耐藥相關研究的基礎。Nahta等[9]應用大劑量（4 μg/ml和8 μg/ml，80倍和160倍的50%抑瘤濃度）持續沖擊誘導SK-BR-3-TS細胞3個月的方法，成功獲得曲妥珠單抗耐藥細胞模型。本試驗在預試驗期間，采用上述方法誘導細胞耐藥，耐藥克隆形成密度低，耐藥細胞集落少，后來改良采用間歇大劑量沖擊聯合逐步增加劑量（初始劑量0.5 μg/ml，10倍的50%抑瘤濃度，階梯式增加2倍濃度直至8 μg/ml）的方法，同時誘導過程中根據細胞克隆形成情況，間歇地往細胞培養液中補充一定量的親代細胞，整個誘導時間6個月，于含4 μg/ml曲妥珠單抗培養液中穩定培養1個月，成功獲得及穩定培養曲妥珠單抗獲得性耐藥細胞系SK-BR-3-TR，此結果證實，間歇大劑量沖擊和逐步增加劑量相結合的方法可成功誘導SK-BR-3-TS對曲妥珠單抗耐藥。這為下一步研究奠定了基礎。

長鏈非編碼RNA是指一類長度超過200個核苷酸，無蛋白質編碼功能但具有表觀遺傳調控等多個生物學功能的RNA分子，與惡性腫瘤的發生發展及藥物抵抗有關[3，10-11]。HOTAIR是第一個被發現具有反式轉錄調控作用的長鏈非編碼RNA，長約2 158 nt，位于哺乳動物基因組12q上HOXC位點[12]。Rinn等[13]首次發現HOTAIR通過表觀遺傳學調控基因的表達，作用方式類似于腳手架。一方面，HOTAIR 5端結合染色質多梳蛋白抑制復合體（polycomb repressive complex 2，PRC2）。PRC2主要由甲基轉移酶EZH2、SUZ12和EED3個亞基組成，可介導H3K27的三甲基化進而沉默特定基因的轉錄。另一方面，HOTAIR3端可結合組蛋白去甲基化酶1（lysinespecific demethylase 1， LSD1）復合體（LSDl/CoREST/REST），介導H3K4me2的去甲基化，調節靶基因的轉錄激活。乳腺癌體外研究及全基因組學研究結果提示，HOTAIR通過募集PRC2和LSD1復合體到乳腺癌細胞靶基因啟動子區，導致包括TGF-β、JAK/STAT、PI3K/AKT、PTEN等信號通路相關基因在內的850多個基因表達發生變化，促進了乳腺癌細胞的侵襲轉移[4]。另有研究提示，HOTAIR還參與了乳腺癌上皮間質轉化進程，且與乳腺癌細胞干性維持有關[14-17]。Li等[18]在人喉鱗狀細胞癌模型中研究發現，HOTAIR能引起PTEN甲基化，下調PTEN蛋白表達，從而導致PI3K/AKT通路活性增強，促進癌細胞的增殖和轉移。

本課題應用HER2陽性、曲妥珠單抗敏感的乳腺癌細胞系SK-BR-3成功誘導及穩定培養曲妥珠單抗獲得性耐藥細胞SK-BR-3-TR，通過檢測發現耐藥細胞較親代細胞HOTAIR表達明顯上調，這提示HOTAIR可能在SK-BR-3-TR細胞曲妥珠單抗耐藥中發揮作用。這一結果為進一步探討HOTAIR與乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的關系及分子機制提供了初步的理論依據。

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（收稿日期：2019-12-17） （本文編輯：桑茹南）