雙七他克林對青光眼模型大鼠視神經的保護作用

方家華，宋小云，胡 蓉，劉俊賢，許銀娥

0引言

青光眼是一種不可逆致盲性眼病，可導致視神經萎縮甚至失明，視網膜神經節細胞是受損的主要靶細胞，其軸突組成視神經。目前針對青光眼的主要治療方法是降低眼壓。但是，有研究顯示，即使患者眼壓降低到正常范圍內，視神經損害仍然繼續發展，因此需要給予神經保護治療[1]。相對于單一靶點藥物，多靶點藥物具有更好的神經保護作用。雙七他克林是一種人工合成的多靶點藥物，具有抑制膽堿酯酶、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體、一氧化氮合酶、鈣通道等多種藥理作用[2]。前期實驗結果顯示，雙七他克林通過抑制NMDA受體抑制谷氨酸引起的視網膜神經節細胞損傷[3-4]，體內實驗證實雙七他克林對大鼠視網膜缺血再灌注損傷具有保護作用[5]。美金剛胺是一種NMDA受體抑制劑，在美國已進入青光眼視神經保護的Ⅲ期臨床試驗，但評估試驗結束后被停止進入Ⅳ期臨床試驗，尚未應用于臨床[6]。本研究通過制作青光眼大鼠動物模型，觀察雙七他克林的視神經保護作用，并與美金剛胺進行對比。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：成年健康雄性SD大鼠24只，出生12wk，體質量280～320g, 購于湖南斯萊克景達實驗有限公司(合格證號：1107271911002941),飼養溫度18℃～25℃，濕度40%～70%。主要試劑：雙七他克林購自Cayman公司，美金剛胺購自Sigma公司，鼠源性Brn3a一抗購自Millipore公司，鼠源性βⅢ-tubulin一抗購自Covance公司，羊抗鼠二抗(含488nm或546nm熒光探針)，Triton X-100購自Dow公司。 主要儀器設備：冰凍切片機(Leica，CM1950)，熒光顯微鏡(Leica，AF6000)。動物實驗通過長沙市第一醫院倫理委員會審查。

1.2方法

1.2.1大鼠青光眼模型的制作將24只SD大鼠隨機分為4組，即對照組、手術組、雙七他克林組和美金剛胺組，每組各6只。配置濃度為1.75mol/L的高滲氯化鈉溶液，用孔徑0.22μm的過濾器過濾后備用。手術組、雙七他克林組和美金剛胺組大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉，暴露右眼上鞏膜靜脈，在解剖顯微鏡下，用33G注射針插入到右眼上鞏膜靜脈，使用Hamilton微量注射器緩慢注射高滲氯化鈉溶液50μL，僅注射1次。模型制作后檢測眼壓，清醒狀態下，結膜囊點奧布卡因滴眼液表面麻醉后使用TonoPen眼壓計測量眼壓，每3d測量1次，若眼壓≥28mmHg，右眼眼壓比左眼高5mmHg，則視為模型制作成功[6]。對照組大鼠右眼僅進行上鞏膜靜脈穿刺，不注射高滲氯化鈉溶液。

1.2.2給藥方式造模后，對照組和手術組大鼠給予正常飲水，雙七他克林組和美金剛胺組大鼠飲用水中每天分別添加0.5mg/kg雙七他克林和5mg/kg美金剛胺，持續5wk。

1.2.3免疫熒光染色造模后5wk，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉大鼠，采用4%多聚甲醛進行心臟灌注，摘除右側眼球，分離角膜并將其放置在4%多聚甲醛中過夜，然后用10%、20%、30%蔗糖梯度脫水，包埋劑包埋后放入-80℃冰箱保存。用冰凍切片機制作經過視神經的切片，厚度5μm，每個眼球選取3張連續切片使用Brn3a抗體對視網膜神經節細胞染色，βⅢ-tubulin抗體對視網膜神經節細胞的軸突進行染色。PBS漂洗3次，5%山羊血清(含0.2% Triton X-100)封閉1h。在4℃環境下，用Brn3a/βⅢ-tubulin一抗(稀釋比例1∶100)孵育24h。然后PBS漂洗3次，加入含DAPI的熒光二抗(稀釋比例1∶100)，在4℃環境下孵育24h。PBS漂洗3次，甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察拍照，對從一側鋸齒緣經過視神經到另一側鋸圖1青光眼模型大鼠的眼壓情況。

齒緣的所有Brn3a染色陽性細胞進行計數，選取離視神經200μm的βⅢ-tubulin染色陽性視網膜神經節細胞的軸突，用Image J軟件測量其厚度。

統計學分析：采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若存在差異，則使用Dunnett-t檢驗進行對照組與其他三組的比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1青光眼模型大鼠的眼壓情況制作青光眼模型后，模型大鼠右眼眼壓均升高，造模3d后達到28.92±2.55mmHg，6d后達到32.45±3.66mmHg。造模后每3d檢測一次眼壓，連續監測1mo，模型大鼠右眼眼壓均值均維持在28mmHg以上，且均比對側眼眼壓(20.34±0.31mmHg)高5mmHg及以上(圖1)，模型制作成功。

2.2青光眼模型大鼠視網膜神經節細胞情況免疫熒光染色結果顯示(圖2A)，視網膜神經節細胞層(GCL)、內核層(INL)、外核層(ONL)細胞核DAPI染色均呈陽性(藍色)。在GCL層可見兩種細胞，其中Brn3a染色陽性和DAPI染色陽性的細胞(黃色)為視網膜神經節細胞。對照組、手術組、雙七他克林組、美金剛胺組大鼠右眼從一側鋸齒緣經過視神經到另一側鋸齒緣的視網膜神經節細胞數分別為119.50±8.26、79.83±9.58、109.00±7.04、107.33±8.57個，差異有統計學意義(F=24.31，P<0.01，圖2B)，其中手術組大鼠右眼視網膜神經節細胞數顯著少于對照組，差異有統計學意義(P=0.001)，雙七他克林組和美金剛胺組大鼠右眼視網膜神經節細胞數亦少于對照組，但差異均無統計學意義(P=0.106、0.054)，表明雙七他克林和美金剛胺能夠抑制青光眼所致的視網膜神經節細胞減少。

2.3青光眼模型大鼠視網膜神經纖維層厚度情況免疫熒光染色結果顯示(圖3A)，在GCL層相鄰的神經纖維層可見βⅢ-tubulin染色陽性的神經纖維(綠色)。對照組、手術組、雙七他克林組、美金剛胺組大鼠右眼距離視神經200μm的視網膜神經纖維層厚度分別為13.40±0.60、6.64±0.50、12.26±0.78、10.13±1.19μm，差異有統計學意義(F=80.527，P<0.01，圖3B)，其中手術組和美金剛胺組大鼠右眼視網膜神經纖維層厚度較對照組明顯變薄，差異均有統計學意義(P<0.01)，雙七他克林組大鼠右眼視網膜神經纖維層厚度較對照組亦變薄，但差異無統計學意義(P=0.063)，表明雙七他克林能夠抑制青光眼所致的視網膜神經纖維層萎縮。

圖2 視網膜神經節細胞免疫熒光染色結果 A：距離視神經200μm的免疫熒光染色圖片(×100)。GCL：節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；ONL：外核層。B：四組大鼠右眼視網膜神經節細胞數目比較。bP<0.01vs對照組。

圖3 視網膜神經纖維層厚度 A：距離視神經200μm的免疫熒光染色圖片(×100)。GCL：節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；ONL：外核層。B：四組大鼠右眼視網膜神經纖維層厚度比較。bP<0.01vs對照組。

3討論

本研究使用大鼠青光眼模型，在飲用水中加入藥物，口服給藥，證實多靶點藥物雙七他克林對視網膜神經節細胞具有保護作用，可以抑制神經節細胞的數目下降及視網膜神經纖維層變薄，對青光眼模型大鼠具有視神經保護作用。

青光眼造成的視神經損傷是復雜的級聯反應，視神經及視網膜組織等受損后，無法通過細胞分裂、增生而代償凋亡或死亡的神經細胞[7]。多靶點藥物的藥理作用可能與神經損傷具有一一對應或多階段對應關系，其神經保護作用可能比單一靶點藥物好[8]。美金剛胺是NMDA受體阻止劑，其在體外實驗及青光眼模型猴的實驗中對視網膜神經節細胞損傷具有抑制作用，但是在進行到Ⅲ期臨床試驗時被終止，未應用于臨床。

雙七他克林是由抗阿爾茲海默癥的藥物他克林衍生而來，具有多種藥理作用。體外實驗已經證實雙七他克林對谷氨酸誘導的視網膜神經節細胞損傷有抑制作用，在視網膜缺血再灌注實驗中，通過熒光金逆行標記視網膜神經節細胞[3]，證實雙七他克林可以減少視網膜神經節細胞的凋亡。細胞電生理實驗證實，雙七他克林可以抑制NMDA受體[4]。本研究在體外實驗和急性視網膜缺血性損傷實驗后使用慢性青光眼模型研究雙七他克林的視神經保護作用，并使用Brn3a抗體對視網膜神經節細胞進行染色，Brn3a在視網膜神經節細胞的細胞核表達[9]。青光眼時眼壓升高，玻璃體谷氨酸濃度增加，激活細胞膜的NMDA受體，使大量鈣離子內流，激活細胞凋亡酶，引起視網膜神經節細胞凋亡，導致興奮性損傷。本研究發現，雙七他克林和美金剛胺對青光眼大鼠的視網膜神經節細胞數目減少均有抑制作用，可能與抑制NMDA受體減少興奮性損傷有關。此外，雙七他克林的視神經保護作用可能還與抑制一氧化氮合酶等藥理機制有關。

視網膜神經節細胞的軸突向眼球后極部匯聚，組成視神經，高眼壓使視網膜神經節細胞死亡，軸突也發生萎縮，最終導致視神經萎縮。βⅢ-tubulin是視網膜神經節細胞軸突的特異性染色劑[10]，越臨近視神經，軸突厚度越厚。本實驗測定了離視神經200μm距離的神經纖維層厚度，結果顯示雙七他克林可以抑制神經纖維層的萎縮，這與雙七他克林抑制視網膜神經節細胞數目減少的結果一致。

綜上所述，本研究通過構建大鼠青光眼模型證實，雙七他克林可以抑制青光眼所致視網膜神經節細胞的數目下降及視網膜神經纖維層變薄，對視神經具有保護作用，這對臨床治療青光眼具有潛在意義。