玻璃體腔注射TA對光化學誘導大鼠BRVO模型血管生成及Notch通路的影響

韓莎莎, 張賀鵬, 李躍峰

0引言

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是視網膜血管病變造成的眼部血管病，影響視力，嚴重時使患者失明[1]，視網膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)是其中一種類型，可通過治療緩解癥狀。曲安奈德(triamcinolone acetonide，TA)屬于腎上腺皮質激素類藥物，因抗炎和抗過敏作用強且時間久在眼科疾病中應用廣泛，可減少BRVO患者眼內新生血管生成[2]，但具體作用機制尚不明確。新生血管受多種基因調控，其中血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是作用最強、特異性最高的血管生長因子之一，幾乎參與血管形成的所有步驟[3]；Notch信號通路在血管生成中的作用已明確，可促進血管生成[4]，能促進VEGF激活從而發揮促血管生成作用等[5]。本研究通過構建化學誘導大鼠BRVO模型，觀察TA對BRVO大鼠的新生血管的抑制作用并探討其作用機制，旨在揭示其抑制血管新生的分子機制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性SD大鼠購自廣州醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(粵)2016-0158，體質量200～230g，SPF級。所有大鼠均飼養于溫度23℃±2℃、濕度50%±10%，光照/黑暗12h/12h環境中，均自由飲水飲食。所有實驗均經本院動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器眼內灌注液(美國Alcon，進口注冊標準：YZB/USA 0661)，孟加拉紅鈉鹽(上海北諾生物科技有限公司，貨號：330000-1G)，戊巴比妥鈉緩沖液(吉林省神經精神病醫院制藥廠，國藥準字：H1400546)，40mg/mL TA注射液(昆明積大制藥股份有限公司，國藥準字：H53021604)，熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字：H44023401)，勻漿緩沖液(上海谷研實業有限公司，貨號：GOY-0993)，一抗VEGF、血管內皮生長因子受體(VEGF receptor 2，VEGFR2)、Notch1、Jagged1、DLL4、GADPH，二抗羊抗兔、羊抗鼠(英國abcam)。

眼科裂隙燈顯微鏡(意大利CSO，型號：SL990/SL980)，Tonolab系眼壓計(上海玉研科學儀器有限公司，型號：iCare Tonnlab)，眼底熒光造影儀(日本Canon、型號：CF-60UD)、光學相干斷層掃描儀(日本Topcon，型號：3D OCT-1 Maestro)、蛋白印記(Western Blot，WB)曝光儀(上海天能科技有限公司，型號：Tanon4600)。

1.2方法

1.2.1制備光化學誘導BRVO大鼠模型實驗前對所有大鼠眼科裂隙燈顯微鏡下檢查眼部，未發現異常。60只大鼠參照文獻中方法右眼單眼構建BRVO模型[6-7]。實驗前用眼內灌注液配置好質量濃度為50mg/mL的孟加拉紅鈉鹽，4℃避光保存備用。術前用2.5%戊巴比妥鈉緩沖液45mg/kg腹腔注射麻醉并擴瞳。尾靜脈注射孟加拉紅鈉鹽溶液50mg/kg，1min后放置角膜接觸三面鏡。顯微鏡下按照龍盤等[6]操作方法尋找視盤顳側第一個視網膜靜脈主干分叉，光凝波長647nm、功率360mW、光斑大小100μm、持續時間0.05s激光光凝，單點光凝20點。鏡下觀察血流中斷、形成靜脈血栓，完全阻塞3個視網膜分支靜脈即為造模成功。造模后4只死亡、3只白內障、1只視網膜凹陷、4只視網膜脫落嚴重，造模成功48只做后續實驗。空白對照組14只大鼠注射同樣體積的眼內灌注液處理。

1.2.2實驗分組按隨機數字法分為BRVO模型組14只、TA組34只，TA組術后按參照文獻中方法給藥8μL TA[8]。30G針頭顳側角膜緣后0.5mm做一穿刺口，微量注射器從穿刺口垂直進針約1.5mm，針尖可觀察到在玻璃體內，緩慢注入8μL TA，顯微鑷子輕夾穿刺口片刻易于穿刺口閉合。TA組分別在玻璃體腔注射TA后1、7、21d進行觀察。BRVO模型組和空白對照組按上述方法注入等體積、等滲眼內灌注液，BRVO模型組在光凝后1d做對照實驗，空白對照組同一天進行實驗。

每組隨機選4只大鼠眼壓計測量眼壓狀況；眼底彩照、熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)及光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)觀察大鼠眼底血管情況。空白對照組、BRVO組另外10只，TA組其余大鼠中TA注射1、7、21d選10只WB檢測血管生成相關因子VEGF、VEGFR2，Notch通路重要因子Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達情況。

1.2.3眼壓計測量眼壓狀況空白對照組、BRVO模型組、玻璃體腔注射TA后1、7、21d組分別在早上9∶00按1.2.1方法麻醉大鼠，麻醉10min后眼壓計測每只大鼠右眼眼壓，每只眼睛測量3次，取平均值。

1.2.4 FFA及OCT檢測大鼠眼底血管情況各組大鼠檢測眼壓后散瞳，10% 2mL/kg熒光素鈉注射液腹腔注射，待熒光素鈉循環至眼底，眼底熒光造影儀按規范操作以視盤和激光光凝點為中心對大鼠右眼行FFA檢查；FFA檢查后行OCT檢查，之后再行眼底照相。測量損傷處視網膜及損傷250μm處視網膜厚度，由兩位操作熟練的工作人員測量和分析結果，取兩位測量人員測量平均值為損傷處視網膜和損傷250μm處視網膜厚度。

圖1 各組大鼠眼底照相觀察視網膜情況比較 A:空白對照組;B:BRVO模型組;C:玻璃體腔注射TA后1d組;D:玻璃體腔注射TA后7d組;E:玻璃體腔注射TA后21d組。白色箭頭:視網膜變白；黑色箭頭:視盤凹消失；黃色箭頭:視網膜血管收縮；藍色箭頭:血管擴張和彎曲。

圖2 各組大鼠FFA情況比較 A:空白對照組;B:BRVO模型組;C:玻璃體腔注射TA后1d組;D:玻璃體腔注射TA后7d組;E:玻璃體腔注射TA后21d組。黑色箭頭：熒光滲漏；白色箭頭：血管擴張和彎曲；矩形：血管阻塞。

1.2.5 WB檢測大鼠視網膜VEGF、VEGFR2、Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達情況各組選取10只大鼠快速處死，解剖顯微鏡下摘取大鼠右眼視網膜，WB檢測大鼠視網膜VEGF、VEGFR2、Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達情況。-80℃冰箱保存待用。

冰箱中取出視網膜，每個組織加100μL勻漿緩沖液，冰上勻漿，低溫離心機4℃、10000r/min離心15min，取上清放入新的離心管中測總蛋白。每孔總蛋白上樣量20μL，經SDS-凝膠電泳分離后，蛋白質轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，3%牛血清白蛋白稀釋VEGF、VEGFR2、Notch1、Jagged1、DLL4、GADPH，一抗4℃孵育過夜；加入對應二抗室溫孵育1h。WB曝光儀檢測目標蛋白信號并分析。

統計學分析：采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量數據均采用均數±標準差表示，先采用單因素方差分析各組間總體比較，若存在差異則使用Dunnett-t檢驗行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠各項指標比較各組大鼠眼壓比較差異有統計學意義(F=3.3817,P=0.025)。各組大鼠損傷處視網膜厚度比較差異有統計學意義(F=5.292,P=0.007)。各組大鼠損傷250μm處視網膜厚度比較差異有統計學意義(F=10.982,P<0.001)。各組大鼠VEGF蛋白含量比較差異有統計學意義(F=73.272,P<0.001)。各組大鼠VEGFR2蛋白含量比較差異有統計學意義(F=23.636,P<0.001), 見表1。

2.2各組大鼠眼底照相情況比較空白對照組眼底血管排列整齊、狀態清晰。BRVO模型組眼底出現水腫，視網膜變白，血管排列紊亂，并伴隨有視盤凹消失、視網膜血管收縮癥狀。玻璃體腔注射TA后1d組水腫減輕，視網膜蒼白減少，出現血管擴張和彎曲，視網膜血管紊亂。玻璃體腔注射TA后7d組視網膜變白加重，血管擴張和彎曲現象嚴重。玻璃體腔注射TA后21d組血管彎曲減輕、視網膜變白消失，視盤凹恢復，見圖1。

2.3各組大鼠FFA情況比較正常組視網膜熒光在血管中均勻分布。BRVO模型組視網膜血管熒光素滲漏明顯。玻璃體腔注射TA后1d組未觀察到熒光滲漏情況，但血管擴張彎曲嚴重、血管部分血管熒光不完整。玻璃體腔注射TA后7、21d組無熒光現象，血管彎曲現象逐漸緩解，見圖2。

2.4各組大鼠OCT檢查比較與正常對照組相比，BRVO模型組損傷處視網膜、損傷250μm處視網膜厚度增加，差異均有統計學意義(P=0.050、0.016)。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1d組損傷250μm處視網膜厚度減少，差異有統計學意義(P=0.048)；玻璃體腔注射TA后7、21d組損傷處視網膜、損傷250μm處視網膜厚度均減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖3。

2.5各組大鼠視網膜血管生成相關因子VEGF、VEGFR2蛋白表達情況與空白對照組相比，BRVO模型組VEGF、VEGFR2蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1、7d組VEGFR2蛋白表達降低，玻璃體腔注射TA后21d組VEGF、VEGFR2蛋白表達均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖4。

2.6各組大鼠視網膜Notch通路重要因子Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達情況與空白對照組相比，BRVO模型組Notch1、Jagged1蛋白表達升高，DLL4蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1、7、21d組Notch1、Jagged1蛋白表達降低，玻璃體腔注射TA后TA7、21d組DLL4蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2,圖5。

李夏[16]針對真空碳熱還原法提鋅進行了研究。先采用真空碳熱還原法提取鋅，得到含鋅、氯化鈉、氯化鉀及部分微量金屬的冷凝物；再經過水洗去除冷凝物中的氯化鈉、氯化鉀；隨后采用真空蒸餾法去除鉛、鋁等微量金屬元素，得到含碳和鋅的成分，利用熔析法去除碳，得到鋅；最后，真空控氧法得到納米氧化鋅。該方法較為新穎，但真空碳還原的要求較高，難以實現工業化生產。

圖3 各組大鼠OCT檢查比較 A:空白對照組;B:BRVO模型組;C:玻璃體腔注射TA后1d組;D:玻璃體腔注射TA后7d組;E:玻璃體腔注射TA后21d組。

組別眼壓(n=4,mmHg)損傷處視網膜厚度(n=4,μm)損傷250μm處視網膜厚度(n=4,μm)VEGF(n=10)VEGFR2(n=10)空白對照組17.58±0.85186.88±51.56191.52±16.320.04±0.020.39±0.13BRVO模型組23.85±3.66a286.77±63.22a245.53±27.88a0.76±0.21a0.56±0.09a玻璃體腔注射TA后1d組25.63±5.62217.85±69.37208.17±11.52c0.81±0.130.47±0.08c玻璃體腔注射TA后7d組21.56±3.57110.88±57.34c167.56±16.41c0.68±0.120.35±0.11c玻璃體腔注射TA后21d組18.81±0.86c156.23±42.56c186.68±11.56c0.21±0.09c0.17±0.04c F3.38175.29210.98273.27223.636P0.0250.007<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vsBRVO模型組。

圖4 各組大鼠視網膜VEGF、VEGFR2表達情況。

圖5 各組大鼠視網膜Notch通路重要因子Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達情況。

3討論

RVO屬常見的眼底血管病，臨床表現為視網膜血液瘀滯、靜脈迂曲擴張、視網膜出血和水腫等血管異常癥狀，會導致患者視力下降或部分視野缺陷，分為中央RVO和BRVO，且BRVO發病率高于中央RVO[9]。Khayat等[10]研究結果發現，視網膜缺血會造成視力喪失、增加新血管并發癥風險。本研究發現BRVO模型組眼底彩照發現視網膜變白，血管排列紊亂，視盤凹消失，視網膜血管收縮，FFA發現視網膜血管熒光素滲漏明顯、出現血管不完整，阻塞現象，造模成功。進一步研究發現，BRVO模型組損傷處視網膜、損傷250μm處視網膜厚度增加，眼壓升高，BRVO使眼壓升高，視網膜受到損害，血管出現異常。玻璃體腔注射TA可緩解大鼠BRVO癥狀[11]，TA作為腎上腺皮質激素類藥物，可減輕充血，降低毛細血管的通透性，在眼科疾病中應用廣泛，可緩解BRVO引起的血管增生現象[12]。本研究發現，與BRVO模型組相比，隨著時間延長，TA使視網膜水腫減輕、視網膜蒼白減少、血管擴張和彎曲、視盤凹恢復，血管彎曲現象逐漸緩解，損傷處視網膜、損傷250μm處視網膜厚度降低，眼壓降低。提示TA可使眼底血管水腫、視網膜血管收縮現象逐漸好轉，可緩解視網膜及其250μm處視網膜損傷癥狀，可緩解BRVO帶來眼壓升高癥狀，對治療BRVO有一定的療效，但具體機制尚未清楚。

組別Notch1Jagged1DLL4空白對照組0.24±0.060.17±0.060.12±0.03BRVO模型組1.21±0.42a0.36±0.08a0.01±0.00a玻璃體腔注射TA后1d組0.68±0.21c0.16±0.04c0.02±0.01玻璃體腔注射TA后7d組0.63±0.19c0.13±0.02c0.11±0.02c玻璃體腔注射TA后21d組0.28±0.06c0.12±0.02c0.13±0.02cF28.95638.99293.611P<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vsBRVO模型組。

VEGF是血管生成中最關鍵的血管生成刺激因子，幾乎參與所有生理和病理性血管生成過程，已被驗證可以促進血管生成[13]。VEGFR2是VEGF介導血管生成的主要受體，VEGF過表達可激活VEGFR2，激活后的VEGFR2可促進內皮細胞分裂、促進細胞增殖，進而促進血管生成[14]。臨床上抗VEGF注射聯合玻璃體切除的動靜脈鞘管切開術可用于治療BRVO[15]。本研究發現，與空白對照組相比，BRVO模型組VEGF、VEGFR2蛋白表達升高。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后7d組VEGFR2蛋白表達降低，玻璃體腔注射TA后21d組VEGF、VEGFR2蛋白表達降低。提示BRVO可使促血管生成因子VEGF、VEGFR2表達量升高進而促進血管形成，加快BRVO疾病進程；TA可降低促血管生成因子生成，緩解血管生成，從而治療BRVO。

Notch信號通路可使血管穩定性加強、促進血管平滑肌細胞分化以及促進血管動靜脈分化，加速血管生成[16]。在信號通路中Notch1可促進血管新生及血管發展，Jagged1和DLL4是Notch信號通路中兩個重要配體，在血管形成中存在平衡關系，起相反作用。Jagged1能促進血管動脈化和促進造血干細胞形成，可抑制DLL4的激活從而加強血管生成作用，同時還發現可激活VEGF[17]。DLL4可抑制血管出芽過程中端細胞的形成從而抑制血管新生[18]。但是尚未發現Notch信號通路在BRVO中相關研究。本研究發現，與空白對照組相比，BRVO模型組Notch1、Jagged1蛋白表達升高，DLL4蛋白表達降低，提示BRVO可能通過激活Notch信號通路，促進血管動脈化和促進造血干細胞形成、抑制端細胞形成、從而加速血管形成。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1、7、21d組Notch1、Jagged1蛋白表達降低，玻璃體腔注射TA后7、21d組DLL4蛋白表達升高，提示TA可緩解BRVO激活的Notch信號通路，減少血管動脈化和造血干細胞生成，促進端細胞形成，抑制血管形成；同時抑制血管生成刺激因子VEGF的表達，使血管生成相關細胞的分裂、增殖受到抑制，進而抑制血管形成，達到緩解BRVO疾病目的。

綜上所述，TA可能通過抑制Notch通路激活，抑制VEGF表達，減輕血管生成，實現對BRVO保護作用。本研究只對BRVO模型組光凝1d進行了研究，沒有做后期對照研究，是本文不足之處，也是下一步研究重點；且深入探討Notch通路與VEGF的作用機制是下一步需要深入探討的內容。