AgNO3逆轉的黃芩組培玻璃化苗的活性成分含量及其生物活性研究

王勝芳 韓淑蘭 黨士坤 王慧梅

(東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.)為唇形科(Labiatae)多年生草本植物，是一種典型的藥食同源藥材，具有清熱燥濕、解毒、止血和安胎的功效[1]，對慢性疾病患者有良好的保健作用[2]。黃芩還是一種良好的天然抑菌劑，臨床抗菌性能好且無耐藥性[3～4]，其提取物具有抗炎[5]、抗氧化[6]和抗腫瘤[7]的作用。因此，黃芩具有較高的研究價值，目前，國內外對黃芩中藥材需求量也日益增加，但我國野生黃芩資源有限無法滿足巨大的市場需求。植物組織培養離體繁殖技術能夠在短時間內繁殖出生長速度快，次生代謝產物含量高的優良無性系，而且對外界環境的依賴性低，管理方便，可以實現工業化生產。因此黃芩的快速繁殖技術已成為解決該問題的重要手段之一。但在黃芩的組織培養過程中，組培苗玻璃化現象嚴重制約了這一技術的應用。

近年來，有不少的專家學者針對試管苗玻璃化的機制進行研究，并取得了一定的進展，其中被大眾廣泛認可的觀點是AgNO3通過競爭乙烯的作用位點抑制乙烯的合成及信號的傳導，進而抑制保衛細胞中H2O2的積累，導致氣孔的密度及孔徑增大，失水量增加，植物玻璃化程度減輕，進而發生逆轉[8]。

本研究首先以組培黃芩玻璃化苗為材料，研究AgNO3對玻璃化苗的逆轉作用，確定AgNO3的最適濃度；在此基礎上，對恢復了1個月的黃芩玻璃化苗中活性成分的含量及其生物活性進行研究。為黃芩組織培養快速繁殖體系的建立提供理論依據和技術支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

將2個月的黃芩實生苗莖段于75%酒精溶液中殺菌30 s，然后用無菌水清洗3遍，再用4%的NaClO消毒2 min，無菌水清洗3～5遍，用無菌的干燥濾紙吸干其表面的水分，剪成1 cm左右的莖段，接種于MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1固體培養基中，25 d后，將愈傷組織轉入分化培養基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1中,待再生芽長到1 cm左右時轉到繼代增殖培養基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1中進行繼代增殖培養，1個月后將獲得的玻璃化苗和正常的組培苗用于后續實驗。

1.2 研究方法

1.2.1 AgNO3對黃芩玻璃化苗的逆轉作用

將黃芩的玻璃化苗接種到MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7 g·L-1+AgNO3(不同濃度)的培養基中，AgNO3的濃度為0，2，4，6，8，10 mg·L-1，每個濃度設6個平行，每瓶接種10棵，30 d后統計黃芩玻璃化苗的逆轉率。

1.2.2 黃芩苷含量的測定

采用高效液相色譜(HPLC)法對黃芩苷的含量進行定量檢測[9]。稱取新鮮的植物樣品0.2 g在液氮中研磨成粉。以60%的乙醇溶液(10 mL)為提取溶劑，采用超聲處理法(30 min，60℃)提取黃芩苷。重復3次，合并濾液并離心(10 000 r·min-1，15 min)，取上清液濃縮、過濾后，上機檢測。

測定方法：使用的HPLC系統由Waters1525高效液相色譜儀、Waters2478檢測器和Waters SunFire C18色譜柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)組成。流動相為甲醇∶水(含0.2%的磷酸溶液)=35∶65(V∶V)，流速為1 mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長280 nm，進樣量20 μL。測得黃芩苷的標準曲線方程為Y=2.134X+3.15(R2=0.990 7)，借助標準曲線方程計算樣品中黃芩苷的含量。

1.2.3 黃芩提取物的抗氧化活性檢測

采用DPPH自由基清除法[10]檢測黃芩提取物的抗氧化能力。10 mg DPPH溶解于100 mL甲醇中，得0.1 mg·mL-1的DPPH貯備液。向盛有1 mL樣品提取液(制備方法同1.2.2)的各離心管中加入2 mL DPPH溶液，混勻后立即用比色皿在517 nm處測定吸光值Ai。室溫避光保存30 min后再次測定吸光值，記為Aj。對照組吸光值記為Ac，每個實驗組設3個平行。

DPPH自由基的清除率的公式：

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

(1)

抗壞血酸標準品的配制：200 mg的抗壞血酸溶于20 mL甲醇，得10 mg·mL-1抗壞血酸溶液，再將其依次稀釋為1.25，0.625，0.312 5，0.156 25，0.078 125 mg·mL-1，制備標準曲線。試驗測得標準曲線方程為Y=40.414X+44.913(R2=0.995 4)，借助標準曲線方程可計算IC50值。

1.2.4 黃芩提取物的體外抑菌試驗

細菌的活化：挑取3～5株大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、鮑曼不動桿菌(A.Bauman)分別接種到含5 mL LB培養基的試管中，震蕩培養24 h。將活化的菌液倒入盛有20 mL LB培養液的玻璃瓶中，再震蕩培養4～7 h，將菌液濃度調整為1×106CFU·mL-1左右。

藥品的制備：稱取2 g干燥的植物樣品研磨成粉，加入70%的乙醇溶液100 mL超聲提取1 h，重復提取3次，離心后合并上清液，將上清液蒸干得到黃芩活性物質。稱取黃芩活性物質20 mg，用1 mL的超純水溶解完全，得到20 mg·mL-1的抑菌液，以2倍稀釋法梯度稀釋抑菌液至20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5 mg·mL-1，用0.45 μm的濾膜過濾后備用。

1.2.4.1 抑菌圈直徑的測定

采用打孔法[11]檢測黃芩提取物的抑菌直徑。分別取100 μL濃度為1×106CFU·mL-1的菌液均勻涂布于含LB固體培養基的平板表面，用滅菌打孔器在平板上均勻打出4個孔。在每個孔注入500 μg·mL-1黃芩提取液各100 μL，每個樣品設3個重復，37℃培養24 h。以生理鹽水為對照，測量抑菌圈的直徑。

1.2.4.2 最小抑菌濃度(MIC)

用96孔板做最小抑菌濃度試驗[12～13]，每孔加入濃度為1×106CFU·mL-1的活化菌液100 μL，再分別加入濃度為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5 mg·mL-1的樣品提取液各100 μL，只加菌液的孔為對照孔，每個濃度重復3次。37℃條件下培養24 h，在600 nm處檢測菌液OD值找到最小的抑菌濃度。

1.2.4.3 最小殺菌濃度(MBC)

用接種環分別蘸取1.2.4.2試驗所得的菌液劃平板，培養48 h，看是否有菌落出現，若無菌落出現則該濃度就是最小殺菌濃度。

1.2.5 黃芩提取物抗腫瘤活性的檢測

采用MTT法[14～15]檢測黃芩提取物的抗腫瘤活性。將0.8×105細胞/mL的宮頸癌(Hela)和肺腺癌(A549)細胞接種于96孔板，每孔100 μL，置于培養箱中培養16～18 h，加入100 μL黃芩提取物(提取方法如1.2.4)，每個樣品設3個濃度50、25、12.5 mg·mL-1，每個濃度設5個復孔。繼續培養24 h，然后加入20 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續培養4 h，用移液槍吸去所有的培養液，并向每孔中加入150 μL DMSO，振搖10 min，用酶標儀在OD=490 nm處測每孔的吸光值，記為A。調零孔與對照孔的吸光值，分別記為A0和A對照。收集數據并計算黃芩提取物對腫瘤細胞的清除率。

清除率=1-(A-A0)/A對照×100%

(2)

1.2.6 數據的分析

實驗數據采用SPSS 22.0進行數據統計分析，多重比較采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 AgNO3對組培玻璃化黃芩苗的恢復作用

由圖1可知，AgNO3的濃度為4 mg·L-1時，玻璃化苗的逆轉率最高為88%，且恢復苗的生長狀態良好。AgNO3的濃度低于4 mg·L-1時，玻璃化苗的逆轉率較低，玻璃化苗依然存在著玻璃化現象。而當AgNO3的濃度高于4 mg·L-1時，玻璃化苗在恢復的過程中出現了不同程度的枯萎，導致玻璃化苗的死亡率不斷地升高，且隨著AgNO3濃度的升高，玻璃化苗的枯萎程度不斷加重。

圖1 AgNO3對黃芩玻璃化苗的逆轉作用 圖中相同小寫字母表示在0.05水平上差異不顯著，不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。Fig.1 The recovery efficiency of AgNO3 on S.baicalensis plantlets The same lowercase letter in the figure indicates that the difference is not significant at the 0.05 level,while different lowercase letters indicates that the difference is significant at the 0.05 level,the same as below.

2.2 黃芩苗體內黃芩苷含量的測定

黃芩苷是黃芩中最主要的次生代謝產物，其含量的高低直接決定黃芩的質量。根據黃芩苷的標準曲線方程計算可得(圖2)，玻璃化苗(HS)中黃芩苷的含量為38.32 mg·g-1，恢復苗(RS)中黃芩苷的含量為68.56 mg·g-1，正常組培苗(CS)中黃芩苷的含量為108.21 mg·g-1。恢復苗中黃芩苷的含量顯著高于玻璃化苗，但卻明顯低于正常組培苗，僅為正常組培苗的60%多。

圖2 黃芩苗中黃芩苷的含量Fig.2 The content of Baicalin in S.baicalensis plantlets

圖3 黃芩提取物對DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of S.baicalensis extract on DPPH free radical

2.3 黃芩苗提取物的抗氧化活性評價

人體內自由基含量過高可引發多種疾病，如動脈粥樣化、神經變性、慢性抑郁癥、癌癥和生理學衰老等。因此，研究黃芩體內活性成分對自由基的清除作用對于評價黃芩質量的好壞具有一定的指導意義。由圖3可知隨著樣品濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率也在逐漸增加。由圖3可知恢復苗(RS)的IC50值為0.22 mg·mL-1，稍高于正常組培苗(CS)0.17 mg·mL-1，但顯著低于玻璃化苗(HS)1.27 mg·mL-1，僅為玻璃化苗的1/6。

2.4 黃芩提取物的體外抑菌試驗

由表1可知，黃芩提取物對金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、鮑曼不動桿菌(A.Bauman)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)均具有良好的抑制效果。正常組培苗(CS)對各種細菌的抑制效果最佳，抑菌圈的直徑最大，其次是恢復苗(RS)，抑菌效果最差的是玻璃化苗(HS)。由表2可知，黃芩提取物對革蘭式陽性菌(S.aureus和E.coli)的抑制效果優于革蘭式陰性菌(A.Bauman和B.subtilis)，尤其是對S.aureus的抑制效果最佳。黃芩提取物對革蘭式陽性菌的MIC及MBC值較低，均小于10 mg·mL-1，而對革蘭式陰性菌特別是A.Bauman的MBC值則高于20 mg·mL-1。

表1 黃芩提取物對細菌的抑制作用

Table 1 Inhibitory effect ofS.baicalensisextract on bacteria

抑菌圈直徑Inhibition zone(mm)CSRSHSH2O金黃色葡萄球菌S.aureus17.77±0.1613.52±0.1311.98±0.130大腸桿菌E.coli13.13±0.1011.41±0.079.21±0.110枯草芽孢桿菌B.subtilis10.48±0.138.03±0.178.22±0.040鮑曼不動桿菌A.Bauman9.12±0.106.92±0.166.89±0.070

表2 黃芩提取物的最小抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)

Table 2 Minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) ofS.baicalensisextract

黃芩提取物的濃度Drug concentration(mg·mL-1)CSRSHSMICMBCMICMBCMICMBC金黃色葡萄球菌S.aureus1.252.52.552.55大腸桿菌E.coli2.552.55510枯草芽孢桿菌B.subtilis51010201020鮑曼不動桿菌A.Bauman102020—20—

2.5 黃芩提取物的抗腫瘤活性試驗

由圖4可知，黃芩提取物對A549肺癌細胞和Hela宮頸癌細胞具有良好的殺傷作用。相同濃度下正常組培苗(CS)提取液對兩種腫瘤細胞的殺傷率最大，其次是恢復苗(RS)，殺傷率最低的是玻璃化苗(HS)。且隨著黃芩提取物濃度的增加，各樣品對A549肺癌細胞和Hela宮頸癌細胞的殺傷率也顯著升高。

圖4 黃芩提取物對A549肺癌細胞和Hela宮頸癌細胞的殺傷作用Fig.4 The killing effect of S.baicalensis extract on A549 cells and Hela cells

3 討論

研究表明，AgNO3能控制和逆轉組培苗的玻璃化現象。Gao等[8]研究了AgNO3對玻璃化石竹的逆轉作用及其逆轉機制，其研究結果指出在培養基中添加濃度為5 mg·L-1的AgNO3對玻璃化石竹的逆轉作用最強，而且提出AgNO3對玻璃化石竹的逆轉機制是通過爭奪乙烯的作用位點抑制乙烯的生成，使植物體內活性氧含量降低，從而減輕或逆轉組培植物的玻璃化現象。本研究同樣證明了AgNO3對玻璃化黃芩苗具有逆轉作用，且其逆轉作用受AgNO3濃度的影響，AgNO3濃度為4 mg·L-1時，玻璃化苗的逆轉率最高為88%，且恢復苗的生長狀態良好。AgNO3的濃度低于4 mg·L-1時，玻璃化苗的逆轉率較低，玻璃化苗依然存在著玻璃化現象。而當AgNO3的濃度高于4 mg·L-1時，玻璃化苗在恢復的過程中出現了不同程度的枯萎，且隨著AgNO3濃度的升高，玻璃化苗的枯萎程度不斷加重。這可能是因為AgNO3濃度過高時，Ag+可競爭性地進入葉綠素分子內，改變其結構，使其功能喪失，蛋白質的合成受到抑制，從而對植物細胞的生長代謝產生脅迫或毒害作用[16～17]。

黃芩苷是黃芩中最主要的活性物質，其含量的高低直接決定黃芩的質量。本研究結果表明，恢復苗中黃芩苷的含量明顯高于玻璃化苗，卻明顯低于正常苗。此外，黃芩提取物的抗氧化、抗菌、抗腫瘤實驗結果也證明恢復苗的生物活性相比于玻璃化苗有了顯著地提高，卻仍低于正常苗。黃芩苗中黃芩苷的積累主要受光合作用和可溶性蛋白含量的影響[18～19]。一方面，玻璃化苗中葉綠素的含量較低，植株的光合作用較弱，黃芩苷的合成量較少。另一方面，玻璃化苗體內可溶性蛋白含量較低[20]，也限制了黃芩苗中黃芩苷的積累。

綜上所述，AgNO3對組培玻璃化黃芩苗具有良好的抑制及逆轉作用，且恢復苗中活性物質及生物活性較玻璃苗有了顯著地提升，但相比于正常組培苗還有一定的差距。由此我們推測恢復苗體內活性成分含量恢復到正常水平所用時間比其表觀形態恢復所用時間更長。因此今后的研究我們要對AgNO3逆轉的黃芩玻璃化苗體內生物活性成分含量和活性的恢復需要時間進行研究，為黃芩的組織培養快速繁殖技術提供基礎數據和理論依據。

4 結論

AgNO3對黃芩組培苗的玻璃化現象具有良好的抑制和逆轉作用，且最適濃度為4 mg·L-1。在組織培養基中添加AgNO3處理30 d后，恢復苗的表面形態恢復正常，其體內重要的次生代謝產物黃芩苷的積累量和提取物的生物活性和玻璃化苗相比均有顯著的提升，但仍低于正常的組培苗。這說明經AgNO3逆轉的黃芩玻璃化苗體內活性成分的含量和活性的恢復比形態的恢復需要更長的時間。