COL7A1與PLEC雙基因突變致大皰性表皮松解癥一例國內(nèi)首報

于越乾 暴芳芳 劉紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院（山東省皮膚病醫(yī)院）山東省皮膚病性病防治研究所 山東省醫(yī)學科學院，濟南250022

通信作者：劉紅，Email：hongyue2519@hotmail.com

大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa，EB）是由皮膚結構蛋白基因突變導致的機械性大皰性疾病，臨床主要表現(xiàn)為機械性脆性皮膚、張力性大皰和糜爛結痂等。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少18 個基因突變會導致本病發(fā)生，單純型EB 主要致病基因為KRT5、KRT14 和PLEC，交界型EB 由LAMA3、LAMB3、ITGB4 和ITGA6 等 基 因 突 變 致 病，COL7A1 為營養(yǎng)不良型EB 的致病基因［1］。既往認為EB 為單一基因突變所致，但近年國外文獻報道了4 例雙基因遺傳的病例。我們對收集到的1 例EB 家系進行全基因組外顯子測序，結果發(fā)現(xiàn)，患兒COL7A1 和PLEC 基因突變共存，為雙基因突變所致的隱性遺傳營養(yǎng)不良型EB（RDEB），在國內(nèi)為首次報道。

資料與方法

一、臨床資料

先證者男，2 歲，因手足部位出現(xiàn)水皰伴皮膚破損2年，于2018年4月30日來山東省皮膚病性病防治研究所就診。患兒出生后其口唇皮膚即出現(xiàn)破損，左側拇指出現(xiàn)大皰，后雙下肢包括雙足相繼出現(xiàn)水皰和大皰，皮損漸延及全身，并伴劇烈瘙癢。在當?shù)蒯t(yī)院對癥治療（具體不詳），療效不佳，為進一步治療遂來我院。患者無其他伴發(fā)疾病，足月生產(chǎn)，體格及智力發(fā)育均正常。患者家族成員2代4人中沒有類似病史。患者父母非近親婚配。

體檢：一般情況可。皮膚科檢查：頭面、軀干、四肢伸側及手足可見綠豆至核桃大小水皰、糜爛和結痂，四肢關節(jié)易受摩擦處尤為嚴重，尼氏征陰性（圖1）。無血皰，雙手足指趾甲及口腔黏膜未受累。結合病史及皮損表現(xiàn)，臨床擬診：EB。為進一步明確其臨床型別，對患兒進行全基因組外顯子測序。本研究經(jīng)過山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準（批件號20181225KYKT014）。

圖1 患兒臨床照片 軀干（1A）及面部（1B）見綠豆至核桃大小水皰、糜爛，皰液清亮，部分干涸結痂

二、材料和方法

1.DNA 提取：患兒父母簽署知情同意書后，抽取家系中先證者及其父母外周血各5 ml。采用基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因組DNA。

2.全基因組外顯子測序與Sanger測序驗證：構建基因組文庫，通過探針雜交捕獲與EB 相關基因的外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域（50 bp），并進行富集。富集的目的基因片段通過二代高通量測序儀（美國Illumina 公司）進行測序，平均測序深度133.71X，測序數(shù)據(jù)與UCSC 網(wǎng)站中既往報道的EB相關基因組hg19 參考序列進行比對，并對目標區(qū)域的覆蓋度和測序質(zhì)量進行評估，新一代測序由北京信諾佰世醫(yī)學檢驗所完成。得到的原始測序結果排除dbSNP151 數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HapMap Project數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫中存在的單核苷酸多態(tài)性位點，通過BWA軟件對序列進行比對，并優(yōu)先與已報道的EB相關基因比對。

根據(jù)二代測序結果，對篩選的位點進行Sanger測序驗證，并在100例健康對照中驗證該位點。應用SIFT 和PolyPhen 軟件對發(fā)現(xiàn)突變的有害性進行預測。

結 果

先證者PLEC 基因第12772 位核苷酸發(fā)生G→A 雜合突變（NM_000445.4：c.12772G＞A），為新發(fā)突變，導致第4258 位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔╬.Glu4258Lys），先證者母親攜帶該突變，父親不攜帶此突變，此突變系從母親遺傳獲得（圖2）。

同時，先證者COL7A1基因攜帶2個移碼突變，27 號外顯子第3625 位發(fā)生11 個堿基缺失（NM_000094.3：c.3625_3635delTCTGTCCAGAC），74號外顯子第6270 位發(fā)生新發(fā)突變，為1 個堿基缺失（c.6270delT）所致的移碼突變，測序結果見圖3。先證者父親同時攜帶上述2個移碼突變，母親沒有檢測到COL7A1 基因突變，證實患兒COL7A1 的突變來自父親。

所有突變都經(jīng)過反向測序驗證，100 例無關健康對照及公共數(shù)據(jù)庫（dbSNP151數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HapMap Project數(shù)據(jù)庫）中未發(fā)現(xiàn)類似突變。對突變的有害性進行預測，提示以上3個突變均為有害突變，預測有致病性。

討 論

RDEB由編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因突變所致，在不同臨床類型的RDEB中，已報道400多個突變位點。Ⅶ型膠原包括中央三螺旋桿狀膠原區(qū)域以及氨基端和羧基端，是基底膜帶錨纖維的主要組成成分。錨纖維是維持表皮和真皮密切連接的重要結構，缺失會導致皮膚脆性增加［2］。COL7A1 定位在3p21.1，內(nèi)含復雜內(nèi)含子和118 個外顯子［3］。在RDEB患者中，COL7A1突變主要包括錯義突變、剪切位點突變、移碼突變、堿基缺失及插入和甘氨酸置換。影響同源三聚體裝配以及二聚體二硫鍵形成的相關位點的錯義突變較多見，會破壞Ⅶ型膠原的穩(wěn)定性。最嚴重的突變可導致提前終止編碼，無功能肽鏈無法組成錨纖維［4］。本例先證者及其父親在COL7A1攜帶復合突變，27號外顯子c.3625?3635del11 以及74 號外顯子c.6270delT，造成編碼區(qū)移碼突變，提前終止編碼，肽鏈合成提前終止，產(chǎn)生無功能肽鏈。姜薇等［5］于2005 年首次報道1 例Hallopeau?Siemens 型RDEB 患者攜帶COL7A1基因c.3625?3635del11突變。

圖2 先證者及其父母PLEC基因測序結果 患者及其母親攜帶PLEC基因c.12772G＞A突變，父親未攜帶此突變

除COL7A1 基因突變外，本文患兒同時攜帶PLEC基因突變。PLEC基因編碼網(wǎng)蛋白，該蛋白為相對分子質(zhì)量500 000 的中間絲結合蛋白，參與細胞骨架組織的連接［6］，并且富集于基底層角質(zhì)形成細胞，在基底層細胞骨架、半橋粒和基底膜之間起連接作用［7］。PLEC 突變是8%的單純型EB 患者的致病基礎［8］，目前國際上尚未在RDEB 患者中發(fā)現(xiàn)PLEC 基因突變。本研究顯示，先證者PLEC 的第12772 位核苷酸發(fā)生G→A 雜合突變，導致第4258號氨基酸發(fā)生谷氨酸到賴氨酸改變，功能預測有害，而該突變此前未見報道。

本文先證者攜帶COL7A1 與PLEC 基因3 處突變，但無家族史，其父母各攜帶1 個基因的突變位點，提示攜帶單基因突變可能不導致EB 的發(fā)生，這和Floeth 和Bruckner?Tuderman［9］的觀點一致，即單個基因突變位點的發(fā)現(xiàn)不足以證實某些特殊家系的遺傳基礎。雙基因遺傳病指兩個基因累積效應所致的遺傳病，當兩個不同基因突變發(fā)生于同一個體時才會表現(xiàn)出疾病臨床表現(xiàn)。 Vahidnezhad等［10］通過二代測序對91 例EB 家系進行遺傳學分析，明確了68 例家系致病基因及突變位點，仍有25%的患者不能確定致病基因突變。Padalon?Brauch等［11］提出雙基因遺傳可以解釋部分EB高度可變的臨床表型。

圖3 先證者及其父母COL7A1基因測序結果 先證者及其父親同時攜帶COL7A1基因的2個突變，母親該基因未見突變

迄今為止，國內(nèi)外共有4例發(fā)生雙基因突變的EB 家系報道，其中3 例為單純型EB 患者KRT5 和KRT14基因突變共存。Padalon?Beauch 等報道1例患泛發(fā)性單純型EB 的2 歲男孩，從患有局限性單純型EB 的母親遺傳獲得突變KRT5 基因p.Ile183Thr，從無臨床癥狀的父親遺傳獲得突變KRT14 基因p.Arg388His，患兒出生后即出現(xiàn)嚴重的水皰，未累及黏膜［11］。Wertheim?Tysarowska 等［12］報道1例臨床癥狀相似的病例，先證者從沒有臨床癥狀的母親獲得KRT5基因p.Arg471His突變，從患有局限性單純型EB 的父親獲得KRT14 基因突變p.Met272Thr，先證者出生后全身出現(xiàn)廣泛性水皰；Kim 等［13］報道1 例沒有家族史的4 歲患兒，分別從母親和父親遺傳獲得KRT5 基因突變Leu155Pro 和KRT14基因突變Met294Thr，Leu155Pro位于角蛋白5 的1A 保守區(qū)域，Met294Thr 位于角蛋白14 的2B區(qū)域，親水的極性蘇氨酸代替了疏水的非極性蛋氨酸，功能預測皆為有害突變。有趣的是，患兒同母異父的弟弟僅攜帶KRT5 基因Leu155Pro 突變，但未出現(xiàn)臨床癥狀，證實單個基因突變不會導致角蛋白功能缺失。此外，F(xiàn)loeth 和Bruckner?Tuderman［9］報道COL17A1 與LAMB3 雙基因突變的患者，父母親攜帶單一突變且沒有臨床癥狀，患兒同時攜帶雙基因突變，出生即出現(xiàn)皮膚和黏膜受累，結合病理結果，診斷為交界型EB。

雙基因間蛋白產(chǎn)物相互作用以及基因座之間的聯(lián)系是致雙基因遺傳病的基礎。基底膜帶結構由不同基因產(chǎn)物共同維持，EB 雙基因遺傳可能與基因產(chǎn)物相互作用相關。功能實驗證實網(wǎng)蛋白和ⅩⅦ型膠原之間結合有助于維持表皮結構穩(wěn)定［14］。此外，表皮內(nèi)角蛋白5與角蛋白14交聯(lián)形成二聚體構成中間絲，網(wǎng)蛋白C端結構域有助于自身與角蛋白的結合，并協(xié)同發(fā)揮作用以確保與中間絲結合［15］。以上蛋白相關基因的突變，導致無功能蛋白產(chǎn)物，從而導致EB的發(fā)生。

本文報道1 例雙基因突變導致的RDEB 患兒，患兒父親攜帶COL7A1 基因的2 個移碼突變，但并未出現(xiàn)臨床癥狀，推測其另1條正常等位基因可以合成足夠的mRNA 來滿足錨纖維的數(shù)量和質(zhì)量。患兒母親攜帶PLEC 基因的一個點突變，網(wǎng)蛋白雖可以合成，但是錯義突變影響了氨基酸，從而影響了網(wǎng)蛋白的結構和功能。檢索中國知網(wǎng)、維普和萬方數(shù)據(jù)庫以及PubMed 數(shù)據(jù)庫（截至2019 年5 月），顯示本例為國內(nèi)報道的首例攜帶雙基因突變的EB病例，其基因檢測結果進一步豐富了EB 的突變致病基因位點庫，為EB遺傳咨詢提供了新的依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突