二甲雙胍對(duì)人胸水癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

吳雷，孫禹，王玲玲（通訊作者）

（1. 吉林市中心醫(yī)院 胸外科，吉林 吉林 132011；2. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)病學(xué)中心，吉林 吉林 132011）

0 引言

鹽酸二甲雙胍是臨床糖尿病治療常用藥物。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，該藥具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。在流行病學(xué)資料也驚奇的發(fā)現(xiàn)，糖尿病會(huì)增加乳腺癌的患病率，而同時(shí)應(yīng)用二甲雙胍治療的患者這種風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)大幅度降低，但對(duì)于轉(zhuǎn)移性腫瘤的生物學(xué)作用尚無(wú)定論。本研究以乳腺癌轉(zhuǎn)移胸水內(nèi)癌細(xì)胞為樣本，初步探討二甲雙胍對(duì)轉(zhuǎn)移性原代腫瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料。提取我院（吉林市中心醫(yī)院胸外科）乳腺癌患者轉(zhuǎn)移胸水中癌細(xì)胞為樣本，經(jīng)患者知情同意后進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。Hyclone 優(yōu)質(zhì)胎牛血清、雙抗、RPMI1640 及高糖DMEM（Hyclone 公司）。MTT 及二甲雙胍（美國(guó)Sigma公司）。DMSO（上海生工）。藥敏試驗(yàn)試劑盒（北京生物工程有限公）。

1.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移患者胸水癌細(xì)胞原代提取培養(yǎng)及腫瘤細(xì)胞藥敏實(shí)驗(yàn)。取患者肝素抗凝胸水200 mL 放入離心管中，加預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液。去上清RPMI 1640 培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液。以2×106/ mL 細(xì)胞接種25 cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備待測(cè)化療藥物：氟尿嘧啶（25 ug/mL）、博來(lái)霉素（0.6 ug/mL）、順鉑（3.6 ug/mL）、甲氨碟呤（2.75 ug/mL）、絲裂霉素（0.5 ug/mL）、阿霉素（1 ug/mL），根據(jù)待測(cè)藥物的臨床使用計(jì)量及其所對(duì)應(yīng)的血漿峰值濃度（PPC），設(shè)定6 個(gè)檢測(cè)濃度，即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的PPC。每個(gè)濃度作2 個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)定MO：無(wú)藥對(duì)照孔；MI：最大抑制孔。應(yīng)用生物熒光系統(tǒng)（ATP-TCA）進(jìn)行熒光掃描儀測(cè)定及ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，以每個(gè)梯度平均熒光值為縱坐標(biāo)，ATP 含量對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)和變異系數(shù)。

1.3 MTT 法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。將腫瘤細(xì)胞以1×104個(gè)/mL 接種于96 孔板中，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。鹽酸二甲雙胍及阿霉素分別干預(yù)48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20μl，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200μl DMSO，孔板避光條件下輕微震蕩使結(jié)晶充分溶解，在ELX800 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度（A）值，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm，以全細(xì)胞培養(yǎng)液未加細(xì)胞的孔調(diào)零。記錄的結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線，對(duì)各組細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞藥敏實(shí)驗(yàn)。使用生物熒光系統(tǒng)（ATP-TCA）測(cè)定活細(xì)胞指標(biāo)ATP，進(jìn)而判斷抗腫瘤藥物的敏感性和抗性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該腫瘤細(xì)胞的中度敏感藥物為順鉑、阿霉素；耐藥藥物為甲氨碟呤、博來(lái)霉素、絲裂霉素、氟尿嘧啶，見(jiàn)圖1。

圖1 體外化療藥物腫瘤生長(zhǎng)抑制曲線

2.2 MTT 法比較鹽酸二甲雙胍、阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。應(yīng)用MTT 方法對(duì)比分析阿霉素及二甲雙胍藥品對(duì)腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制作用，細(xì)胞抑制率分別為85%及86.7%，結(jié)果顯示鹽酸二甲雙胍優(yōu)于阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。見(jiàn)表1。

3 討論

鹽酸二甲雙胍作為臨床抗高血糖用藥治療2 型糖尿病已經(jīng)60 多年，現(xiàn)已成為各大國(guó)際糖尿病治療指南中推薦的一線和基礎(chǔ)治療用藥[1]。國(guó)內(nèi)外大量流行病學(xué)資料[2]、臨床研究[3]和動(dòng)物試驗(yàn)[4]關(guān)于二甲雙胍抗腫瘤作用的證據(jù)層出不窮，但針對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤的研究甚少。本研究中采用乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸水中癌細(xì)胞為樣本，分別應(yīng)用臨床常用抗癌藥氟尿嘧啶、博來(lái)霉素、順鉑、甲氨碟呤、絲裂霉素、阿霉素進(jìn)行腫瘤細(xì)胞藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系僅存在中度敏感藥物順鉑、阿霉素，其余為耐藥藥物。選擇中度敏感藥阿霉素與鹽酸二甲雙胍作為腫瘤抗性藥品，應(yīng)用MTT 方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞抑制率分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍優(yōu)于阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。關(guān)于二甲雙胍抑制腫瘤的作用機(jī)制研究結(jié)果主要集中在凋亡[5-7]及細(xì)胞周期[8-10]兩個(gè)方面。促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑包括提高轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬作用、增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體以及線粒體介導(dǎo)的凋亡現(xiàn)象等，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)分解、線粒體功能失活以及DNA 降解，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。關(guān)于細(xì)胞周期主要通過(guò)調(diào)節(jié)CDl、E2F1、CDK4、p21、p27 等細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白，將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期。另外也有學(xué)者認(rèn)為二甲雙胍的抗腫瘤作用機(jī)制可能與其直接調(diào)控細(xì)胞代謝有關(guān)，也可能與其降低胰島素等激素水平有關(guān)[11]。二甲雙胍有可能通過(guò)激活A(yù)MPK 酶，導(dǎo)致癌細(xì)胞得不到足夠的細(xì)胞信號(hào)來(lái)分裂而直接發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。目前腫瘤機(jī)制研究、腫瘤藥物靶向治療以及新藥開(kāi)發(fā)是腫瘤學(xué)及藥理學(xué)的研究熱點(diǎn)，鹽酸二甲雙胍是否可以擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍，或者作為2 型糖尿病合并腫瘤疾病患者的首選輔助藥品有待于進(jìn)一步探討及臨床大數(shù)據(jù)的跟蹤報(bào)道。

表1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率