朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥中BRAFV600E、MAP2K1基因突變的分析

孫虹靚，羅建明

（1. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，廣西 南寧 530021；2. 廣西地中海貧血防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

0 引言

朗格漢斯細(xì)胞是一種位于表皮中的特異性樹突細(xì)胞，參與抗原的呈遞作用。朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥（LCH）是一種罕見的疾病，形態(tài)上表現(xiàn)為朗格漢斯細(xì)胞的增殖，其通常與淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)[1]。LCH患者的臨床表現(xiàn)和臨床過程都具有高度的異質(zhì)性，輕則表現(xiàn)為皮膚、骨骼的損害，重者可出現(xiàn)多器官的累及，如肝、腎、脾、造血系統(tǒng)等。LCH 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)其存在著多種基因突變，例如BRAF V600E、ARAF 及MAP2K1 基因等[2]。對于BRAF 和MAP2K1 基因突變對于疾病的預(yù)后判斷依舊存在著爭議，在我國LCH 患者中BRAF和MAP2K1 基因表達(dá)的情況如何，未見有詳盡的報(bào)道，其對疾病預(yù)后的判斷依舊是一個(gè)尚未解決的難題。因此，本研究主要統(tǒng)計(jì)并分析在朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥（LCH）中BRAFV600E 和MAP2K1 基因的突變率及其對于患者預(yù)后的影響，并進(jìn)一步分析它的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料。選擇于我院就診的2011 年1 月至2018 年1月確診為LCH 患者的組織標(biāo)本50 例，其中男性37 例，女性13 例，患者中位年齡為18.3 歲，平均年齡為27.4 歲，其中單系統(tǒng)累積者41 例（82%），多系統(tǒng)累積者9 例（18%），平均隨訪時(shí)間為37.8 個(gè)月。

1.2 PCR 擴(kuò)增和桑格測序。使用DNA 試劑盒提取50 例患者的病理標(biāo)本，其中BRAF 基因檢測的是外顯子（exon）15，主要采用半巢式PCR 的方法進(jìn)行擴(kuò)增。MAP2K1 基因檢測的是exon2 和exon3，根據(jù)文獻(xiàn)記載的引物對基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，純化產(chǎn)物，使用測序儀進(jìn)行測序并利用Chromas 軟件來分析測序圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 24.0 進(jìn)行分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，采用t 檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，用[n（%）]%表示計(jì)數(shù)資料，行χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)，若P＜0.05，則提示存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LCH 中BRAFV600E 和MAP2K1 基因的突變。通過對50 例LCH 患者的標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)基因測序后，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)13 例BRAFV600E 基因突變，約占26%，5 例患者出現(xiàn)有MAP2K1 基因的突變，突變率為10%，研究發(fā)現(xiàn)MAP2K1 和BRAFV600E 基因突變存在有互異性，詳見表1。

2.2 基因突變對LCH 的臨床意義。對LCH 的臨床基本資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示未成年人共29 例，其中出現(xiàn)BRAF V600E 和MAP2K1 基因突變的分別為10 例、4 例，發(fā)生率分別為34.5% 和13.8%。成年人組21 例，其中出現(xiàn)BRAF V600E 和MAP2K1 基因突變的均為2 例，發(fā)生率9.5%。BRAF V600E 和MAP2K1 基因突變更多出現(xiàn)在未成年組，BRAF V600E 基因突變在未成年組與成人組間有顯著性差異（P=0.026），MAP2K1 基因突變在未成年組與成人組間無顯著性差異（P=0.152）。

表1 BRAFV600E 和MAP2K1 基因的突變的分布

3 討論

朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥（LCH）是一種罕見的克隆性疾病，由于其特有的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（組織細(xì)胞形態(tài)上含有大細(xì)胞的組織病變），常與淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨細(xì)胞有關(guān)[3]，長期以來一直被歸類為單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的疾病[4]，LCH 病變包括浸潤的病理性樹突狀細(xì)胞（8%），巨噬細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和富含調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。樹突細(xì)胞表達(dá)高水平的T 細(xì)胞共刺激因子和促炎細(xì)胞因子，細(xì)胞因子與趨化因子受體構(gòu)成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[5]。近來，研究證明大量的樹突狀細(xì)胞可表達(dá)多效細(xì)胞因子骨橋蛋白，促進(jìn)T 輔助細(xì)胞的產(chǎn)生，組織細(xì)胞招募單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞活化，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量組織破壞性酶[6-7]，可導(dǎo)致受累組織的損壞，約75%的患者激活的體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BRAF-V600E（57%）和MAP2K1，提示LCH 有腫瘤增殖的過程[8]。BRAF 突變是一種很有前途的診斷和預(yù)后指標(biāo)，也是BRAFV600E 特異性抑制劑靶向治療的重要指標(biāo)，探測到BRAFV600E 是判斷診斷、預(yù)后和治療的重要指標(biāo)[9]。

BRAF 蛋白是絲氨酸/蘇氨酸激酶RAF 家族的成員，并且是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子為細(xì)胞生長和增BRAF 是RAF 激酶家族的成員，其被RAS 蛋白和RAS 偶聯(lián)受體酪氨酸激酶激活，RAS 和RAF 的活化復(fù)合物將信號(hào)傳遞至絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)的其他部分，包括MEK / ERK 激酶[10]。RAS-RAF-MAPK 途徑是通過將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的受體，從而影響細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡，是許多細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，最常見于黑色素瘤，乳頭狀甲狀腺癌，結(jié)直腸癌，也在血液系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)。絲裂原活化蛋白激酶1（MAP2K1），也稱為 MEK1，編碼MEK1 蛋白激酶，是RAF 的已知下游靶標(biāo)[11]。MAP2K1 的突變與幾種人類癌癥有關(guān)，包括黑色素瘤，肺癌和結(jié)腸腺癌等。近幾年，靶向基因組測序揭示了LCH 中高頻率的MAP2K1 突變，提示與LCH 發(fā)病有相關(guān)性[12]。此外，據(jù)報(bào)道MAP2K1 突變與LCH 中的BRAF 突變相互排斥，這與本研究的結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥中BRAFV600E 和MAP2K1 可發(fā)生基因突變，常見于未成年組，對于患者的生存時(shí)間無明顯影響。