心腦血脈寧對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型MMP-2、TIMP-2表達(dá)的影響*

郭茂娟，馬東明，盧 斌，蘇金玲，范英昌，姜希娟

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193）

心腦血脈寧對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型MMP-2、TIMP-2表達(dá)的影響*

郭茂娟1，馬東明1，盧 斌1，蘇金玲2，范英昌2，姜希娟2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193）

[目的]探討心腦血脈寧對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）表達(dá)的影響。[方法]通過喂養(yǎng)高脂飼料和主動(dòng)脈球囊內(nèi)皮拉傷術(shù)復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，實(shí)驗(yàn)分為模型組，假手術(shù)組，心腦血脈寧組，歷時(shí)15周。處死后，取腹主動(dòng)脈行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察鏡下病變，計(jì)數(shù)斑塊破裂數(shù)，免疫組化方法檢測(cè)MMP-2、TIMP-2蛋白含量。[結(jié)果]1）HE觀察：假手術(shù)組鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，模型組斑塊中心可見大量脂核，斑塊表面覆蓋纖維帽，在斑塊肩部可見殘存泡沫細(xì)胞和大炎細(xì)胞浸潤。心腦血脈寧組介于兩者之間。2）免疫組化結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組MMP-2、TIMP-2蛋白含量明顯升高，差異有顯著性（P＜0.01）；心腦血脈寧組MMP-2與模型組比較表達(dá)降低，差異有顯著性（P＜0.01），而TIMP-2含量與模型組相比有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；心腦血脈寧組能夠有效降低兩者比值，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01）。[結(jié)論]心腦血脈寧干預(yù)家兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，能減少斑塊破裂，其機(jī)制可能與降低斑塊MMP-2含量以及調(diào)節(jié)MMP-2與TIMP-2比值有關(guān)。

心腦血脈寧；易損斑塊；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）引發(fā)急性冠脈綜合征（ACS）是導(dǎo)致冠心病患者死亡的主要原因。近年來經(jīng)過大量的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，易損斑塊的存在是引起臨床事件的罪魁禍?zhǔn)住＿@類斑塊容易發(fā)生破裂繼發(fā)附壁血栓形成或斑塊內(nèi)出血使得斑塊體積迅速增大，造成惡性事件發(fā)生[1-2]。因此，如何穩(wěn)定斑塊成為研究熱點(diǎn)。

心腦血脈寧臨床上多年來用于治療不穩(wěn)定性心絞痛，且療效顯著，但是其作用機(jī)制尚未闡明，設(shè)想該復(fù)方的作用機(jī)制可能與穩(wěn)定斑塊有關(guān)，因此，以心腦血脈寧為研究對(duì)象，觀察該復(fù)方能否穩(wěn)定斑塊，并觀察心腦血脈寧對(duì)斑塊穩(wěn)定的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 純系日本大耳白家兔40只，雄性，體質(zhì)量1.7～2.0 kg，北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（環(huán)境設(shè)施符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)》二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）。單籠飼養(yǎng)，自由飲水。

高脂飼料組成：膽固醇2%（天津市英博生化試劑有限公司批號(hào)：060619，含量＞98%）、新遠(yuǎn)牌大豆色拉油10%（秦皇島金海食品有限公司），普通飼料88%（天津市武清區(qū)科達(dá)養(yǎng)殖中心提供）。

1.2 藥物

1.2.1 受試藥物 心腦血脈寧由天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院提供[批準(zhǔn)文號(hào)：津藥制字（2001）Z第0346 號(hào)]。成人服用劑量，1.6～2.4 g/次，3 次/d；組成：生黃芪、當(dāng)歸、川芎、赤芍、水蛭等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)藥物 蝰蛇毒：廣州蛇毒研究所；戊巴比妥鈉：SIGMA分裝；組胺：Fluka Chemie GmbH CH-9471Buchs；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）一抗 博士德生物工程有限公司 批號(hào)分別為BA0576、BA0569；二抗、三抗：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；DAB試劑盒：（ZLI-9032）北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 輸尿管導(dǎo)管：上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限責(zé)任公司（規(guī)格：F4，生產(chǎn)批號(hào)050802）。球囊：天津市中拓乳膠廠（內(nèi)徑為0.9mm，長10 cm）顯微鏡、照相機(jī) OLYMPUS微型渦旋混合器：上海滬西分析儀器廠XW-80AImage-Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，測(cè)定血脂和體質(zhì)量，依據(jù)血脂和體質(zhì)量分為假手術(shù)組10只，模型組15只，心腦血脈寧組15只。假手術(shù)組飼以普通飼料，模型組：每天每只家兔給予50 g高脂飼料，再以普通飼料補(bǔ)足。心腦血脈寧組：造模完畢1周后，除保持和模型組同樣飼養(yǎng)條件外，參照文獻(xiàn)[3]，家兔灌服心腦血脈寧0.28 g/（kg·d），4周稱量1次體質(zhì)量，調(diào)整藥物劑量，實(shí)驗(yàn)周期為15周。

1.4.2 藥物觸發(fā) 于處死動(dòng)物前24 h和48 h給予兩次藥物觸發(fā)，藥物觸發(fā)參考文獻(xiàn)[2]的方法：以蝰蛇毒（RVV）0.15mg/kg腹膜下注射，30min后耳緣靜脈注射組胺0.02mg/kg。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型復(fù)制 模型組和心腦血脈寧組飼養(yǎng)2周高脂飼料后，行主動(dòng)脈球囊內(nèi)皮拉傷術(shù)，參照文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行：戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，固定，備皮。在無菌條件下，于兔股動(dòng)脈搏動(dòng)最明顯處皮膚消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，分離組織，暴露股動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端備用，動(dòng)脈夾夾住近心端股動(dòng)脈，靠近遠(yuǎn)心端結(jié)扎處作一動(dòng)脈切口并導(dǎo)入4 F無菌球囊導(dǎo)管，放開動(dòng)脈夾并收緊下方細(xì)線，局部壓迫止血，將球囊導(dǎo)管插入15 cm左右，球囊用注射器推注10～15mL空氣，往返回拉球囊3次損傷血管內(nèi)皮，撤出導(dǎo)管和導(dǎo)絲，結(jié)扎股動(dòng)脈并縫合傷口，術(shù)后10萬U/kg青霉素肌注預(yù)防感染，連續(xù)7 d。術(shù)后繼續(xù)飼以高脂飼料，普通飼料補(bǔ)足。假手術(shù)組麻醉固定，備皮，無菌條件下，于兔股動(dòng)脈搏動(dòng)最明顯處皮膚消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，分離組織，暴露股動(dòng)脈，不作動(dòng)脈切口，直接縫合皮膚。

1.5 方法

1.5.1 蘇木精-伊紅（HE）染色 處死動(dòng)物，取出自主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈分支處的主動(dòng)脈，剝凈外膜和周圍脂肪，沿腹側(cè)正中線縱向剪開，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，照相并計(jì)數(shù)斑塊破裂情況，隨即用中性甲醛溶液固定24 h以上，在主動(dòng)脈弓下定位1 cm處，取材制石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)改變。

1.5.2 易損斑塊家兔模型主動(dòng)脈斑塊破裂的計(jì)數(shù) 在HE然色片中計(jì)數(shù)破裂斑塊數(shù)目。破裂的斑塊典型特征是：1）薄的纖維帽。2）較大的脂核。3）較多的炎細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞浸潤。

1.5.3 用免疫組化方法檢測(cè)MMP-2、TIMP-2蛋白含量 光鏡下每張切片于×400隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊視野，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定每個(gè)視野的積分光密度值，取其平均值作為每張切片的結(jié)果。積分光密度數(shù)值大小反映了應(yīng)用免疫組化方法所檢測(cè)的蛋白表達(dá)量的多少。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兔主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察 假手術(shù)組的動(dòng)脈內(nèi)膜平坦完整，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)，中膜平滑肌排列規(guī)整，與彈力板平行。模型組的斑塊中心可見大量脂質(zhì)沉積形成的脂核，斑塊表面覆蓋薄的纖維帽，在斑塊肩部可見殘存的泡沫細(xì)胞和大量炎細(xì)胞浸潤。心腦血脈寧組斑塊中心可見脂質(zhì)沉積形成的脂核，斑塊表面覆蓋較厚纖維帽，在斑塊肩部少量炎細(xì)胞浸潤。

2.2 觀察并計(jì)數(shù)斑塊破裂情況 HE染色觀察易損斑塊纖維帽厚度及炎細(xì)胞浸潤程度。穩(wěn)定斑塊纖維帽平均厚度為0.44mm，而易損斑塊平均厚度僅為0.13mm。心腦血脈寧對(duì)易損斑塊模型家兔，藥物觸發(fā)后，模型組10只家兔中6只10處出現(xiàn)斑塊破裂，而心腦血脈寧組有4只6處出現(xiàn)斑塊破裂。提示心腦血脈寧有穩(wěn)定易損斑塊的作用。

2.3 心腦血脈寧對(duì)易損斑塊模型家兔MMP-2/TIMP-2的影響 見表1。

表1 心腦血脈寧對(duì)易損斑塊模型家兔主動(dòng)脈MM P-2、TIMP-2表達(dá)影響(±s)Tab.1 Effectof Xinnao Xuemaining on expression of MMP-2 and TIMP in vulnerable plaque of rabbitwith atherosclerosis(±s)

表1 心腦血脈寧對(duì)易損斑塊模型家兔主動(dòng)脈MM P-2、TIMP-2表達(dá)影響(±s)Tab.1 Effectof Xinnao Xuemaining on expression of MMP-2 and TIMP in vulnerable plaque of rabbitwith atherosclerosis(±s)

注：與假手術(shù)組比較 ##P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組心腦血脈寧組10 MMP-2/TIMP-2 0.88±0.08 1.22±0.19##0.97±0.19*n 9 1 0 MMP-2光密度值（IOD）3864.56±821.14 10395.76±2003.92##7484.13±1115.37**TIMP光密度值（IOD）4 286.21±766.87 8 862.35±1 808.99##7 605.04±2 278.55

模型組MMP-2、TIMP-2蛋白含量明顯升高，與假手術(shù)組相比，差異有顯著性（P＜0.01）；心腦血脈寧組MMP-2與模型組比較表達(dá)降低，差異有顯著性（P＜0.01），而TIMP-2含量與模型組相比有降低趨勢(shì)，但差異無顯著性（P＞0.05）；心腦血脈寧組能夠有效降低兩者比值，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

中藥復(fù)方“心腦血脈寧片”（生黃芪、當(dāng)歸、川芎、赤芍、水蛭）為天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院的院制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：津藥制（字）2001ZD0346號(hào)，出自清朝王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》中“補(bǔ)陽還五湯”。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁和地龍組成，用以治療氣虛血瘀為主的病證。

在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制AS動(dòng)物模型方法較多且都比較成熟，但復(fù)制易損斑塊破裂模型卻非常困難，這主要與影響斑塊破裂的因素多有關(guān)。目前建立斑塊破裂方法主要有兩類：1）尋找自發(fā)斑塊破裂/血栓形成動(dòng)物模型。2）主動(dòng)誘發(fā)斑塊破裂/血栓形成動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)參照Ab ela等方法采用了球囊拉傷配合高脂飼料，復(fù)制易損斑塊動(dòng)物模型，周期較短，易于制作和成功，在目前缺乏AS斑塊破裂動(dòng)物模型“金標(biāo)準(zhǔn)”情況下，可較好地用于斑塊破裂發(fā)生機(jī)制和篩選穩(wěn)定斑塊藥物研究。

ACS多數(shù)是由于易損斑塊破裂，導(dǎo)致局部血栓形成而造成血管閉塞或不完全閉塞。因此穩(wěn)定斑塊對(duì)防治ACS至關(guān)重要[3]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)斑塊破裂的計(jì)數(shù)，得出心腦血脈寧可以穩(wěn)定易損斑塊；HE染色結(jié)果提示，假手術(shù)組鏡下結(jié)構(gòu)完整，模型組在易損斑塊肩部有大量炎細(xì)胞浸潤，心腦血脈寧組炎細(xì)胞數(shù)目較模型組減少。此外，心腦血脈寧還能夠通過增加易損斑塊纖維帽厚度，增強(qiáng)易損斑塊穩(wěn)定性。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族[4]，MMP-2主要由成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、心肌細(xì)胞等細(xì)胞合成與分泌[5]，易損斑塊內(nèi)聚集著大量炎性細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞，可產(chǎn)生大量MMPs，降解纖維帽下的基質(zhì)成分，使纖維帽變薄，易于破裂。TIMP-2可抑制MMP-2的活性，從而影響整個(gè)MMPs/TIMPs系統(tǒng)。TIMP通過阻礙MMP介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)，抑制基質(zhì)中促血管生成因子的釋放而使MMPs的降解作用局限化，因此MMPs與TIMPs相互之間的作用平衡，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的發(fā)展方向起著重要的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察心腦血脈寧MMP-2，TIMP-2的表達(dá)，結(jié)果：心腦血脈寧可能通過降低細(xì)胞外基質(zhì)中MMP-2表達(dá)，調(diào)整MMP-2/TIMP-2比值，說明心腦血脈寧可以適度地調(diào)節(jié)MMP活性，改善細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，減輕基質(zhì)降解，增加斑塊纖維帽的穩(wěn)定性，穩(wěn)定斑塊。

[1]徐 浩,陳可冀.從對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)變看中西醫(yī)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)與切入點(diǎn)[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,27(1):5-7.

[2]梁 春,黃高忠,吳宗貴.穩(wěn)定斑塊-治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征的新策略[J].中華老年心腦血管病雜志,2000,2(3):207-210.

[3]馬煥云.動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的研究進(jìn)展[J].新醫(yī)學(xué),2006,37(10):692-699.

[4]吳 旻,李玉光,閆純英.基質(zhì)金屬蛋白酶和氧化應(yīng)激在大鼠動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)[J].中國心血管病研究雜志,2007,5(1):55-57.

[5]周憲梁,孫 凱,李昭暉.基質(zhì)金屬蛋白酶與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(12):705-707.

[6]周一軍,張 錦,李 莉,等.糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶2和9與斑塊穩(wěn)定的關(guān)系[J].中國動(dòng)脈硬化雜志,2005,13(1):69-72.

Expression ofMMP-2,TIMP-2 of vulnerable plaque in rabbitswith atherosclerosis treated with Xinnao Xuemaining

GUOMao-juan，MADong-ming，LUBin，atel
(Pathology Laboratory of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193,China)

[Objective]Toobserve the effectsof Xinnao Xuemaining on theexpression ofMMP-2,TIMP-2 of vulnerable plaque in rabbits with atherosclerosis.[Methods]The vulnerable atherosclerotic plaquemodelwas reproduced by operation on abdominalaorta endothelium for inducing sacculus pull injury with the foraging with high cholesterol lipid feeding.Rats were divided into three groups:model group,sham operation group and Xinnao Xuemaining group.The experiment lasted for 15 weeks.After killing at the end of experiment,the sample ofabdominalaortawas collected for HE staining andmicroscopic lesion examination,counting of the number of plaque rupture and detecting the protein content of MMP-2,TIMP-2 by immunohistochemistry.[Results]HE observation was found that in the sham-operated group themorphologic structure was intact.In the center ofmodel group a large number of lipid plaque coreswas seen.The plaquewas covered with fibrous cap,the shoulder patcheswere visible in the remnants of foam cells and large inflammatory cell infiltration exited.In Xinnao Xuemaininggroup thenumberof lipid plaque coreswasbetweenmodeland sham operation group.The results of immunohistochemicalstaining showed thatcompared with sham-operated group,the expression ofMMP-2,TIMP-2 inmodelgroup was significantly increased(P<0.01).Comparedwithmodelgroup theexpression ofMMP-2 in Xinnao Xuemaininggroup reduced significantly(P<0.01).The TIMP-2 levelswee lower,but therewasno statisticaldifference(P>0.05).Xinnao Xuemaining group can effectively reduce both the ratio ofMMP-2/TIMP-2 compared withmodelgroup(P<0.01).[Conclusion]In vulnerable plaque ofatherosclerotic rabbitmodel Xinnao Xuemaining group can reduce the plaque rupture,itsmechanismmay be related to reducing the expression ofMMP-2 and regulating the ratio ofMMP-2 and TIMP-2.

Xinnao Xuemaining;vulnerable plaque;MMP-2;TIMP-2

R285.5

A

1672-1519(2010)02-0150-03

天津市衛(wèi)生局中西醫(yī)結(jié)合專項(xiàng)基金的資助項(xiàng)目（023611611）。

郭茂娟（1980-），女，碩士，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治心腦疾病。

姜希娟。

2009-12-24）