桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的測定及方法學考察*

劉韋鋆 ，趙 駿 ，曾 森 ，劉美平

（1.天津中醫藥大學研究生，天津 300193；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的測定及方法學考察*

劉韋鋆1，趙 駿2，曾 森2，劉美平2

（1.天津中醫藥大學研究生，天津 300193；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

[目的]為提取純化后的桑葉總生物堿供試品中的1-脫氧野尻霉素建立測定方法及對方法學進行考察。[方法]1-脫氧野尻霉素供試品的含量測定采用柱前衍生化高效液相色譜法。[結果]制桑葉總生物堿供試品3份，經測定，供試品中1-脫氧野尻霉素的含量分別為7.99%，8.64%，7.09%。[結論]檢測方法簡單、快速、準確。

桑葉；1-脫氧野尻霉素；柱前衍生化

桑葉，又名“鐵扇子”，始載于《神農本草經》。味苦、甘，性寒，歸肺、肝經。具有“疏散風熱，清肺潤燥，清肝明目”等功效，用于風熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花[1]。有關桑葉降糖活性的機制研究認為與桑葉中的多羥基生物堿的α-糖苷酶抑制作用有密切關系[2]。本研究主要對桑葉總生物堿供試品中的1-脫氧野尻霉素進行測定，考察其方法學的可行性，為提取純化工藝優化的研究提供監控手段。

1 試劑、藥材、儀器

芴甲氧羰酰氯（吉爾生化上海有限公司）；1-脫氧野尻霉素對照品（中新藥業）；大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）；陽離子交換樹脂（天津市海光化工有限公司）；乙腈，甲醇（色譜純，天津市協和昊鵬色譜科技有限公司）；其余試劑均為分析純；試驗用水均為蒸餾水。桑葉藥材（購于天津市藥材公司）。RE-52AA型旋轉蒸發器；Waters-515型高效液相色譜儀；KDM型調溫電熱套；可剪裁型薄層層析板（天津思利達色譜技術開發公司）。

2 方法及結果

2.1 桑葉總生物堿中的1-脫氧野尻霉素的薄層鑒別 取2mg按2.3制得的供試品，加1mL甲醇溶解。取1mgL-脫氧野尻霉素對照品,加1mL甲醇溶解。分別吸取3μL供試品溶液和對照品溶液，點于薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-無水乙醇（2∶8），展開，取出，吹干，碘熏法進行顯色，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.2 桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的含量測定根據文獻報道[3]，1-脫氧野尻霉素的含量測定可采用柱前衍生化高效液相色譜法。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（PhenomsilC18，250mm×4.6mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.1%冰醋酸（11∶16），檢測波長：254 nm，流速：1.0mL/min，柱溫：25℃。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱定1-脫氧野尻霉素對照品5mg，置10mL容量瓶中，加0.05mol/L鹽酸稀釋至刻度,配成濃度為0.5 g/L的1-脫氧野尻霉素對照品溶液。

2.2.3 桑葉總生物堿供試品的配制 取桑葉藥材，加蒸餾水煎煮，過濾，濾液通過大孔吸附樹脂，收集穿透部分液體，減壓濃縮，通過陽離子交換樹脂，蒸餾水洗后，用0.5mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，即得桑葉總生物堿供試品。精密稱定桑葉總生物堿供試品30mg，加0.05mol/L鹽酸定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.4 1-脫氧野尻霉素的衍生化及測定 分別各取對照品和供試品溶液35μL，加入169μL 0.4mol/L硼酸鉀緩沖液（pH=8.5），加入250μL 5mmol/L芴甲氧羰酰氯，混勻，25℃水浴 20 min，加入 25μL 1mol/L甘氨酸、66μL 1%醋酸和162μL蒸餾水，混勻，濾過，測定峰面積。

2.2.5 1-脫氧野尻霉素（DNJ）標準曲線的制備 精密吸取1-脫氧野尻霉素標準對照品溶液分別加鹽酸配制成濃度為 0.04、0.08、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40g/L的對照品溶液。按照2.4的方法進行衍生化反應，得峰面積分別為 333 314，595 354，743 158，1406385，1 655 477，1 953 116。以峰面積（Y）為縱坐標，1－脫氧野尻霉素對照品溶液濃度（X）為橫坐標作圖，得回歸方程：Y＝6 208 109.45X＋109 387.72，線性范圍為：0.04-0.40 g/L，相關系數 r=0.999 4。

2.2.6 精密度實驗 取同一供試品衍生化后的反應液，連續進樣5次，測得峰面積的相對平均標準差（RSD）＝0.5%（n＝5），結果表明，本實驗所用儀器精密度良好。

2.2.7 重復性實驗 在2.1色譜條件下，按2.3方法平行制備5份供試品溶液，按照2.4進行衍生化反應，測定其 DNJ含量，RSD＝2.5%（n＝5），結果顯示，本方法重復性良好。

2.2.8 穩定性實驗 在2.1色譜條件下，取同一供試品衍生化后的反應液，每隔1 h進樣1次，RSD=1.8%（n=5），結果表明，供試品衍生化后在5 h內測定比較穩定。

2.2.9 回收率實驗 精密稱定供試品6份，分別加入DNJ對照品，在2.1色譜條件下，按照2.4進行衍生化反應，測定其DNJ含量。結果見表1。

表1 回收率的考察（n=6）Tab.1 Exam ination of recovery(n=6)

2.2.10 供試品含量測定 測定供試品峰面積，然后用標準曲線方程計算供試品中1-脫氧野尻霉素的含量，分別為7.99%，8.64%，7.09%。

3 討論

3.1 生物堿的定性鑒別 由于1-脫氧野尻霉素不易顯色，筆者先后嘗試了碘化鉍鉀顯色法、硅鎢酸顯色法、雷氏銨鹽顯色法等，顯色效果均不好。最后采用碘熏法，顯色良好。

3.2 衍生化法測定因素的考察

3.2.1 供試品自身干擾情況 將供試品衍生化前后進行比較，衍生化后，可出現目標峰。無衍生化的供試品在254 nm處無吸收。見圖1-3、比較后得出供試品本身在此色譜條件下對測定無干擾。

3.2.2 水浴中反應時間的考察 25℃水浴，分別反應 10、20、30、40min，峰面積為 1198 892，1 349 802，1 297 403，1 315 728。可見水浴中反應20min，峰面積最大。故確定，水浴反應時間為20min最佳。

3.2.3 水浴溫度的考察 分別在20、25、30、35℃水浴中反應20min，峰面積為1 349 802，1 423 646，1 251 938，1 161 261。可見25℃時，峰面積最大。故確定，水浴溫度為25℃最佳。

3.2.4 緩沖劑pH的影響 在衍生化反應過程中，同一供試品加入pH值分別為7.99，8.19，8.50，8.61，8.78 的緩沖劑，峰面積為 496 454，527 976，543 934，542 169，539 723。可見緩沖劑pH值為8.5時，峰面積最大。故確定，緩沖劑pH值為8.5時最佳。

4 結論

制備桑葉總生物堿供試品3份，經測定，1-脫氧野尻霉素的含量分別為7.99%，8.64%，7.09%。本檢測方法簡單、快速、準確。為桑葉有效組分的制備做準備，并給桑葉的綜合利用及糖尿病的預防和治療藥物的開發研究奠定了一定的基礎。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:化學工業出版社,2005：209-209.

[2]李 宏，黃金山，胡 浩，等.桑葉對葡萄糖苷酶活力的影響及降糖機理的研究[J].中國蠶業，2003，24(2)：19.

[3]施新琴，崔為正，裘立群，等.反相高效液相色譜-紫外檢測法測定家蠶和桑葉中1-脫氧野民霉素的含量[J].全國桑樹種質資源及育種和蠶桑綜合利用學術研討會，2005：44-51.

Study on the Measurementand Methodology of 1-deoxynojirim ycin in TotalA lkaloids from Mulberry Leaf

LIUWei-jun,ZHAO Jun,ZENGSen,etal
（Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

[Objective]To extractand purify 1-deoxynojirimycin in totalalkaloids frommulberry leafand to establish themethod of contentdetermination.[Methods]The 1-deoxynojirimycin in totalalkaloids frommulberry leafwasmeasured by using pre-column derivation high performance liquid chromatography.[Results]In thisway，the purity was exceeded above 7.99%，8.64%，7.09%.[Conclusion]Thismethod wassimple，high-speed,and accurate.

mulberry leaf;1-deoxynojirimycin in totalalkaloids;pre-column derivation

R917

A

1672-1519(2010)02-0166-03

高等學校科技創新工程重大項目培育基金項目資助課題（706013）。

劉韋鋆（1982－），男，在讀碩士研究生，主要研究方向為中藥化學。

趙 駿。

2009-11-21）