烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞INHB、FSHRmRNA及分泌功能的影響*

李 玲，金 哲，黃文玲，林佳靜，蔡品均

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞INHB、FSHRmRNA及分泌功能的影響*

李 玲1，金 哲2，黃文玲2，林佳靜1，蔡品均1

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

[目的]運(yùn)用血清藥理學(xué)方法觀察烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞抑制素（INHB）、促卵泡激素受體（FSHR）mRNA的表達(dá)及其分泌功能的影響。[方法]在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入烏萸湯、尿促卵泡激素（FSH）及正常大鼠含藥血清，培養(yǎng)48 h后，分別用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）及放免法測(cè)定顆粒細(xì)胞 INHB、FSHR、mRNA及培養(yǎng)液中雌二醇（E2）含量。[結(jié)果]各用藥血清組E2含量較對(duì)照組均明顯升高；顆粒細(xì)胞INHB、FSHRmRNA表達(dá)量明顯增多，其中烏萸湯中劑量血清組效果優(yōu)于西藥組。[結(jié)論]烏萸湯含藥血清能明顯促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞INHB、FSHRmRNA的表達(dá)以及E2分泌，說(shuō)明烏萸湯可以通過(guò)調(diào)控卵巢局部因子、增強(qiáng)FSHRmRNA的表達(dá)從而提高卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)性，改善下丘腦-垂體-卵巢軸，促進(jìn)E2的分泌，以促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及排出。

烏萸湯；卵巢顆粒細(xì)胞；抑制素；促卵泡素受體；雌二醇

卵巢顆粒細(xì)胞（GC）是卵泡內(nèi)主要的功能細(xì)胞之一，是雌激素和孕激素的主要來(lái)源細(xì)胞。GC的增殖和分化是卵泡不斷發(fā)育和成熟的基本條件。本研究組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，補(bǔ)腎調(diào)肝方烏萸湯可提高卵巢儲(chǔ)備功能，促進(jìn)卵泡發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用血清藥理學(xué)原理，研究烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分泌及促卵泡激素受體mRNA（FSHRmRNA）、抑制素（INHB）表達(dá)的影響，以進(jìn)一步了解烏萸湯調(diào)節(jié)卵巢功能的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠25只，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量（150±20）g；未成年雌性SD大鼠10只，21～25日齡，體質(zhì)量50～70 g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎調(diào)肝方烏萸湯組方：烏藥、山茱萸、菟絲子、肉蓯蓉、丹參、雞血藤、香附、煅紫石英等。按課題需要計(jì)算得出總量，將藥物從北京同仁堂股份有限公司一次性購(gòu)入，核實(shí)飲片基原、產(chǎn)地、批號(hào)、性狀，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（2005年版）》要求鑒定為正品后，由北京中醫(yī)藥大學(xué)制劑室按常規(guī)方法一次性煎煮、濃縮，按照所需配成高、中、低濃度藥液，2～8℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器 注射用尿促卵泡激素（FSH 75IU/支）購(gòu)自麗珠制藥廠，孕馬血清（PMSG1000IU/支）購(gòu)自內(nèi)蒙古赤峰博恩藥業(yè)有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM-F12培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液均購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)公司（GIBCO/BRL）；雌二醇（E2）放免檢測(cè)藥盒，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物，購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV Reverse Transcriptase） 購(gòu)自 Promega公司，DNA Marker購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖購(gòu)自深圳晶美公司；INHB酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，購(gòu)于武漢中美生物試劑有限公司。

低溫高速離心機(jī)：Sigma；半自動(dòng)發(fā)光儀：日本濱松；光學(xué)顯微鏡：NIKON ECL IPSE E600；全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Model550型Microplate Reader。倒置相差顯微鏡，日本Olympus IMT－2型。二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)NAPCOMODEL5410。超凈工作臺(tái)，北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司CJT-E-Ⅱ型。電熱恒溫水箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠，HH-W21.420型。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠含烏萸湯中藥血清與正常血清制備 取25只6周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。小鼠飼料、墊料、飲用水均經(jīng)過(guò)消毒處理。正常對(duì)照組每日灌服0.5%的羧甲基纖維素鈉（C MC）1.0mL/kg；大、中、小劑量組每日灌服烏萸湯濃縮液5、10、15mL/kg（分別相當(dāng)于成人劑量的6倍、12倍、18倍），連續(xù)給藥4 d；西藥對(duì)照組大鼠每日皮下注射FSH 78 U/kg，連續(xù)4 d，各組樣本均無(wú)死亡。于末次給藥后1 h無(wú)菌狀態(tài)下大鼠股動(dòng)脈采血，分離血清，將每組血清混勻，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 卵巢顆粒細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng) 參照Lovekamp等[1]的方法，取10只上述未成年雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 100 IU，48 h后頸椎脫臼法處死。75%乙醇浸泡消毒，在無(wú)菌條件下迅速剖取卵巢放入冰冷的無(wú)菌PBS中，去除卵巢周?chē)M織及表面包膜，PBS清洗后置于冰冷的DMEM-F12培養(yǎng)基中。在解剖顯微鏡下用小號(hào)針頭刺破卵泡，使顆粒細(xì)胞釋放入培養(yǎng)基，200目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾。800 r/min離心5min，洗滌濾液，收集細(xì)胞。加入培養(yǎng)液（D MEM-F12培養(yǎng)基、15%胎牛血清、105U/L，青霉素和105U/L鏈霉素）制成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞稀釋成濃度為3.0×108個(gè)/L的細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞可貼壁生長(zhǎng)，換液去除未貼壁細(xì)胞；此后隔日換液1次。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 顆粒細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24 h后分6組換液，每組于含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入10%的大、中、小劑量組中藥血清、西藥對(duì)照組血清、正常大鼠對(duì)照組血清，并設(shè)空白對(duì)照組（DMEM-F12培養(yǎng)基）。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

2.4 用放免法測(cè)定烏萸湯方含藥血清對(duì)顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2分泌的影響 用放射免疫法測(cè)定各組細(xì)胞上清液E2的含量。測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。放射免疫法分析符合質(zhì)控要求，批內(nèi)變異系數(shù)<10%，批間變異系數(shù)<15%。

2.5 烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FSHR mRNA表達(dá)量的定量測(cè)定 用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）方法實(shí)時(shí)、定量測(cè)定顆粒細(xì)胞FSHR mRNA的表達(dá)量。

2.6 烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞INHB的影響 本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）技術(shù)，觀察烏萸湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞INHB的表達(dá)的影響。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用one－Way ANOVA進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 烏萸湯含藥血清對(duì)各組卵巢GC分泌E2及FSHRmRNA、INHB的表達(dá)影響 見(jiàn)表1。

表1 烏萸湯含藥血清對(duì)各組卵巢GC分泌E2及FSHRm RNA、INHB的表達(dá)影響(±s)Tab.1 effectsofW u Yu decoction drug-containing serum on serection of E2 ofGC and the expression of FSHRmRN,INBH of GC(±s)

表1 烏萸湯含藥血清對(duì)各組卵巢GC分泌E2及FSHRm RNA、INHB的表達(dá)影響(±s)Tab.1 effectsofW u Yu decoction drug-containing serum on serection of E2 ofGC and the expression of FSHRmRN,INBH of GC(±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與西藥對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與烏萸湯低劑量組比較☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與烏萸湯中劑量組比較★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別 n E2空白對(duì)照組正常對(duì)照組西藥對(duì)照組烏萸湯低烏萸湯中烏萸湯高6 6 6 6 6 6(pg/105)15.8317±2.8444 17.8867±3.3713 41.3500±11.029**▲▲35.6017±12.896**▲▲34.7600±9.0657**▲▲32.5050±4.1909**▲▲GCFSHRmRNA（起始拷貝數(shù)）1.1333±0.1797△△1.0267±0.1453△△5.6067±0.4273**▲▲5.3450±0.4093**▲▲7.9217±0.7511**▲▲△△☆☆5.0350±0.4984**▲▲△★★INHB(pg/105)15.8922±0.0353 15.8213±0.0381 16.8973±0.1029 16.7913±1.0916 19.2798±1.0518**▲▲△△☆☆17.7770±1.4172**▲▲

由表1可見(jiàn)，空白對(duì)照組與未用藥大鼠血清組的E2分泌及FSHRmRNA、INHB的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與空白及正常對(duì)照組相比，各加藥組E2、FSHRmRNA、INHB的表達(dá)量均明顯增高（P<0.01）；與西藥血清組比較，烏萸湯低、中、高劑量血清組 E2水平偏低，但無(wú)顯著性差異（P>0.05），烏萸湯中、高劑量血清組FSHRmRNA、INHB表達(dá)有顯著性升高（P>0.05）。

3.2 Real-time PCR結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成 將預(yù)實(shí)驗(yàn)的PCR產(chǎn)物（mRNA表達(dá)比較高的）按照濃度梯度進(jìn)行稀釋，選擇1/5，1/10，1/20，1/40濃度的稀釋產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品模版，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。通過(guò)這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品生成的反應(yīng)數(shù)據(jù)，軟件Rotor-Gene 6.0根據(jù)反應(yīng)的熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度關(guān)系，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

3.2.2 FSHR Real-Time PCR溶解曲線，溶解曲線圖顯示擴(kuò)增的內(nèi)參基因GAPDH和目的基因FSHR cDNA的溶解溫度(Tm)分別為87.0℃，85.0℃，且均為單峰。無(wú)非特異性擴(kuò)增，見(jiàn)圖2。

4 討論

FSH是調(diào)節(jié)女性卵巢功能的關(guān)鍵激素，但FSH需與位于卵巢顆粒細(xì)胞上的FSHR結(jié)合后方可激活顆粒細(xì)胞內(nèi)的芳香化酶(P450arom)，使卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生的雄激素芳香化并形成卵泡自身內(nèi)的雌激素微環(huán)境[2]。因此，雌激素的生成還受卵泡內(nèi)FSHR含量的限制，卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)與顆粒細(xì)胞FSHRmRNA的表達(dá)量高低有關(guān)[3]。抑制素INHB是一種選擇性抑制FSH分泌的性腺肽，可以增強(qiáng)卵巢-垂體軸的反饋性調(diào)節(jié)[4]。INHB主要由卵巢顆粒細(xì)胞分泌，卵巢儲(chǔ)備功能出現(xiàn)減退時(shí)，血清INHB先于FSH產(chǎn)生變化。血清INHB水平降低是女性卵泡減少、卵巢老化的最早標(biāo)志[5]，在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域具有重要意義。INHB對(duì)FSH負(fù)反饋調(diào)節(jié)的減弱，可導(dǎo)致FSH水平的增高。INHB還可以通過(guò)調(diào)節(jié)增加E2底物來(lái)調(diào)節(jié)E2的產(chǎn)生。因此，INHB和FSH、E2一樣可以反映卵巢的功能狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示各用藥組GC分泌E2均有提高，而FSH含藥血清提高GC分泌E2效果優(yōu)于中藥各組；補(bǔ)腎調(diào)肝方烏萸湯可以增加卵巢顆粒細(xì)胞INHB和FSHRmRNA的表達(dá)，其中劑量組效果優(yōu)于FSH含藥血清組，由此可見(jiàn)，烏萸湯可通過(guò)提高卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)性及調(diào)控卵巢局部因子途徑為靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢系統(tǒng)，同時(shí)可直接對(duì)卵巢起調(diào)節(jié)作用。從而說(shuō)明補(bǔ)腎調(diào)肝治療對(duì)女性性腺軸功能具有雙相調(diào)節(jié)作用，能夠使下丘腦-垂體-性腺軸的功能得以改善，達(dá)到促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟以調(diào)經(jīng)促孕的目的。中藥的多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)作用，而不僅僅是代替激素的作用，可能正是中醫(yī)藥調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌的特點(diǎn)和意義所在。

[1]Lovekamp TN,Davis BJ.Mono-(2-ethylhexy)phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulosa cells[J].ToxicolApplPharmacol,2001,172(3):217-224.

[2]De Castro F,Ruiz R,Montoro L,et al.Role of follicle-stimulating hormone receptor Ser680Asn polymorphism in the efficacy of follicle-stimulatinghormone[J].Fertil Steril,2003,80(3):571-576.

[3]樓航英,黃荷鳳,金 帆.超排卵時(shí)卵巢對(duì)促性腺激素的反應(yīng)與顆粒細(xì)胞促卵泡激素受體的表達(dá)[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版),2002，31(3)∶151-154.

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Effects of Wu Yu decoction drug-containing serum on expression of INHB,FSHRm RNA in ovarian granulose celland secretion function

LILING1,HUANGWen-ling2,JIN Zhe2,atal
(1.ClinicalCollegeofBeijing University ofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.DepartmentofGynecology,Dong Fang Hospital,Beijing University ofChineseMedicine,Beijing 100078,China)

[Objective]To research theeffectsofWu Yu decoction drug-containing serum on the expression of INHB,FSHRmRNA in ovarian granulose cell(abbr.GC)and the secretion function in rats.[Methods]Wu Yu decoction,FSH drug-containing serum and the normal ratserum were added into ratovarian GC culturemedium system.Theywere cultured for48 hours.The expression of INHBwasmeasured by ELISA,FSHRmRNA expression levels by RT-PCR,E2 levelsofeach group by radioimmunoassay.[Results]The E2 levelwas significantly higher in treatmentgroups than that in controlgroups,and the expression of INHB,FSHRmRNA significantly increased,among themmedium dosagegroup ofWu Yu decoctionwas superior than that inWesternmedicine groups.[Conclusion]Wu Yu decoction drug-containing serum promotes the expression of INHB,FSHRmRNA and secretion of E2 ofovarian GC significantly.It is proved thatWu Yu decoction can enhance the ovarian reaction function to gonadotropins and improve the HPOA through adjusting internal factors ofovary and enhancing the expression of FSHRmRNA,thereby to promote the developmentandmaturation of follicular and ovulation.

Wu Yu decoction；ovarian granulose cell；INHB； FSHRmRNA；E2

R285.5

A

1672-1519(2010)02-0144-03

教育部新教師基金（20070026036）。

李 玲（1977-），女，博士研究生，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)婦科內(nèi)分泌、輔助生殖方面研究。

2009-12-26）