龍膽苦苷生物合成候選調(diào)控基因GrbHLH1的挖掘、克隆與表達(dá)分析

李彩霞,王元忠,王梅媛,梁 芳,張曉東*

(1.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,中國(guó)云南玉溪653100；2.許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,中國(guó)河南許昌461000；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,中國(guó)云南昆明650223)

滇龍膽是云南省道地藥材,其藥用部位為根及根莖,主要藥效成分為龍膽苦苷[1]。研究表明龍膽苦苷在龍膽植物綠色器官中合成,經(jīng)過(guò)莖,最后運(yùn)輸?shù)礁績(jī)?chǔ)藏[2～4]。龍膽苦苷的生物合成主要分3個(gè)階段：1)前體形成階段,包括質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)途徑和胞質(zhì)甲羥戊酸(mevolonate,MVA)途徑,生成異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)[5]；2)碳骨架結(jié)構(gòu)形成階段,起始于香葉基焦磷酸(geranyl diphosphate,GPP),止于裂環(huán)番木鱉苷的合成[6～8]；3)萜類(lèi)化合物的后修飾階段,主要通過(guò)細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶和糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成[8]。目前,滇龍膽在生產(chǎn)上存在的主要問(wèn)題之一是栽培藥材龍膽苦苷含量低,并且不同產(chǎn)地藥材的龍膽苦苷含量差異較大[9],導(dǎo)致市場(chǎng)上的滇龍膽藥材質(zhì)量參差不齊,直接影響到臨床藥效[4]。為提高滇龍膽中的龍膽苦苷含量,金琳等[10]使用不同濃度的茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)對(duì)花期滇龍膽葉片進(jìn)行噴施,結(jié)果表明100 mg/L的MeJA噴施8 d后葉中龍膽苦苷含量達(dá)到最高。另有研究報(bào)道,通過(guò)在植物組織中導(dǎo)入同源或異源結(jié)構(gòu)基因,也能夠提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量[11～12]。目前,基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的龍膽苦苷生物合成途徑的第一、二階段已經(jīng)清楚[13]。但是,由于該途徑中酶的底物或產(chǎn)物含量低,且不能直接商業(yè)化購(gòu)買(mǎi),所以第三階段的研究仍然進(jìn)展緩慢[13～14]。

轉(zhuǎn)錄因子能同時(shí)誘導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可大幅度提高酶基因的表達(dá)及活性產(chǎn)物的產(chǎn)量[14～16]。在長(zhǎng)春花中,bHLH轉(zhuǎn)錄因子堿性螺旋-環(huán)-螺旋環(huán)烯醚萜類(lèi)合成1(bHLH iridoid synthesis 1,CrBIS1)和 CrBIS2均能形成二聚體,反式激活環(huán)烯醚萜生物合成途徑中從GPP到番木鱉酸之間酶基因的表達(dá),從而促進(jìn)長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿中環(huán)烯醚萜部分的生物合成[15,17]。在蒺藜苜蓿中,三萜皂苷生物合成激活調(diào)控子1(triterpene saponin biosynthesis activating regulator 1,MtTSAR1)和MtTSAR2能夠通過(guò)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子中的N-box[CACG(A/C)G],分別激活非溶血性大豆皂苷和溶血性大豆皂苷的生物合成[18～19]。在青蒿中,轉(zhuǎn)錄因子AabHLH1通過(guò)結(jié)合紫穗槐-4,11-二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)、細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,CYP71AV1)和 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)編碼基因啟動(dòng)子中的E-box元件來(lái)激活這些基因的表達(dá),從而促進(jìn)青蒿素的生物合成[20]。在甘草中,轉(zhuǎn)錄因子GubHLH3能夠通過(guò)激活香樹(shù)素合酶基因(βamyrin synthase,bAS)、香樹(shù)素羥化酶基因CYP93E3和CYP72A566的表達(dá),來(lái)促進(jìn)大豆皂苷Ⅰ、Ⅱ的生物合成[21]。這些結(jié)果表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控單萜或三萜的生物合成[15,17～19]。

在滇龍膽根和葉的轉(zhuǎn)錄組中,轉(zhuǎn)錄因子bHLH的數(shù)量最多,表明bHLH在滇龍膽生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等方面起重要作用[13]。本研究首先通過(guò)序列比對(duì)方法獲得滇龍膽GrbHLH1基因；然后通過(guò)共表達(dá)分析方法,確定GrbHLH1為滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑的候選調(diào)控基因；再根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中僅有的1條GrbHLH1基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物,通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功從滇龍膽葉片中擴(kuò)增到GrbHLH1基因,并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)特異性分析,以期為滇龍膽GrbHLH1基因的功能研究及其在龍膽苦苷生物合成中的調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

滇龍膽于2018年4月30日采自臨滄市云縣臨滄耀陽(yáng)生物藥業(yè)科技有限公司后箐種植基地,由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所王元忠副研究員鑒定為Gentiana rigescens Benth。使用剪刀分別剪取兩年生滇龍膽的根、莖、葉和花,用錫箔紙包被后,投入液氮中,帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃保存。

RNA提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD19-T 載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(2× Mix)、Takara Taq 酶、嵌合熒光檢測(cè)試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside,X-gal)、氨芐青霉素、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1購(gòu)自瑞典Amersham公司；膠回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,DNA測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 GrbHLH1基因與龍膽苦苷生物合成途徑基因的共表達(dá)分析

使用長(zhǎng)春花中調(diào)控環(huán)烯醚萜類(lèi)生物合成的CrBIS1基因(GenBank登錄號(hào)：KM409646.2)在滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn搜索(E-value=10-5),獲得一條bHLH基因序列,命名為GrbHLH1。分別取本課題組2013年測(cè)序的滇龍膽根和葉轉(zhuǎn)錄組中龍膽苦苷生物合成途徑上的乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(acetoacetyl-CoA acetyltransferase,也稱(chēng)acetoacetyl-CoA C-acetyltransferase或acetoacetyl-CoA thiolase,AACT)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase,HMGS)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)、甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase,PMK)、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶(diphosphomevalonate decarboxylase,MVD)、1-脫氧-D-核酮糖5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)、1-脫氧-D-木酮糖 5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase,DXR)、2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase,CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK)、2-C-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環(huán)二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl，4-diphosphate synthase,HDS)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸還原酶 (1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR)、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)、牻牛兒基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase,GPPS)、香葉醇合酶(geraniol synthase,GES)、香葉醇10-羥化酶(geraniol 10-hydroxylase,G10H)、8-羥香葉醇氧化還原酶(8-hydroxygeraniol oxidoreductase,8HGO)、環(huán)烯醚萜合酶(iridoid synthase,IS)、環(huán)烯醚萜氧化酶(iridoid oxidase,IO)、7-脫氧番木鱉苷酸配基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase,7DLGT)、7-脫氧番木鱉苷-7-羥化酶(7-deoxyloganic acid 7-hydroxylase,DL7H)、裂環(huán)番木鱉苷合酶(secologanin synthase,SLS)的編碼基因與GrbHLH1基因在根和葉中的FPKM(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced,每一百萬(wàn)個(gè)片段中來(lái)自某一基因每一千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目)值,將同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本FPKM總和作為該基因的總表達(dá)量,使用pheatmap軟件包制圖,檢測(cè)GrbHLH1基因與龍膽苦苷生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因是否存在共表達(dá)現(xiàn)象。

1.2.2 葉片總RNA提取及GrbHLH1基因的克隆

按照植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取滇龍膽嫩葉總RNA,隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。根據(jù)原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)和滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中GrbHLH1基因序列comp79308_c1的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物GrbHLH1EcoRⅠ-F：GAATTCATGTCAGGAACTTCATGGATCT(下劃線(xiàn)為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),GrbHLH1XhoⅠ-R：CTC-GAGTTATTCAAGCAACAGAGCTGATC(下劃線(xiàn)為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為PrimeSTAR Max DNA Polymerase(2× Mix)25 μL、模板 2 μL、正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃變性10 s,59℃退火15 s,72℃延伸30 s,30循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物加A尾后,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,然后切膠,使用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收,將其連接到pMD19-T載體。將連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行藍(lán)白篩選,挑取白斑搖菌；使用堿裂解法提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切檢測(cè)正確后,將1 mL菌液送公司進(jìn)行DNA測(cè)序,從而獲得正確的重組質(zhì)粒pMD19-GrbHLH1。將含有重組質(zhì)粒的菌液保存于終濃度為20%的甘油中,置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 GrbHLH1基因的生物信息學(xué)分析

使用Genetyx version 6.1.8軟件將GrbHLH1基因ORF的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列,隨后采用NCBI網(wǎng)站上的BLASTp程序進(jìn)行序列相似性搜索,獲得與GrbHLH1蛋白相似性較高的序列。使用DNAMAN version 7軟件進(jìn)行GrbHLH1蛋白與CrBIS1、CrBIS2蛋白的多序列比對(duì),尋找他們的保守區(qū)結(jié)構(gòu)域。選取擬南芥bHLH蛋白[18]；長(zhǎng)春花 CrBIS1[18]、CrBIS2[18]和 CrMYC2[18]；蒺藜苜蓿MtTSAR1[19](GenBank登錄號(hào)：AJE29377.1)和MtTSAR2[19](GenBank 登錄號(hào)：ALH07115.1)；滇龍膽GrbHLH1(GenBank登錄號(hào)：AIA82919.2)和Gr-MYC2蛋白(GenBank登錄號(hào)：AIA82919.2),使用MEGA version 10.0.5軟件內(nèi)置的Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì),然后使用鄰接(neighbour-joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),設(shè)置bootstrap=1 000。使用在線(xiàn)軟件 ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。利用在線(xiàn)軟件CAI(http：//www.detaibio.com/tools/codon-adaptation-index-calculator.html)進(jìn)行密碼子適應(yīng)指數(shù)分析。使用在線(xiàn)軟件 ChloroP version 1.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)；利用在線(xiàn)軟件SignalP version 5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；使用在線(xiàn)軟件 SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使用在線(xiàn)軟件SSpro(http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用在線(xiàn)軟件SWISS-MODEL(http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)的自動(dòng)模式進(jìn)行同源建模；利用在線(xiàn)軟件TMHMM version 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜螺旋區(qū)；利用在線(xiàn)軟件WoLF PSORT(https：//wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況。使用在線(xiàn)軟件InterPro version 75.0(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 GrbHLH1基因的實(shí)時(shí)定量分析

選取3株健康和生長(zhǎng)勢(shì)相同的兩年生滇龍膽植株,分別剪取根、莖、葉和花,每個(gè)器官取3個(gè)樣品,提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。以滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中的GrACTIN基因(GenBank登錄號(hào)：KM061808)為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物qGrACTIN-F(5′-GCGGATCGTATGAGCAAGGA-3′)和 qGrACTIN-R(5′-GGGGCCGGATTCTTCGTATT-3′),定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative PCR,qPCR)產(chǎn)物長(zhǎng)度為174 bp。根據(jù)GrbHLH1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物qGrbHLH1-F(5′-CAAAGAGGGCGCAACAATCC-3′)和 qGrbHLH1-R(5′-TTGTTGACTGAGCTGCTCCC-3′),qPCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度119 bp。使用嵌合熒光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qPCR,反應(yīng)條件：95℃15 s,60℃15 s,72℃10 s。擴(kuò)增反應(yīng)在LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增曲線(xiàn)、溶解曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由qPCR儀軟件自動(dòng)生成。使用內(nèi)參基因GrACTIN表達(dá)校準(zhǔn)后,采用比較 Ct值的 2-△△Ct方法[22]計(jì)算出根、莖、葉和花中GrbHLH1基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 GrbHLH1基因是滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑的候選調(diào)控基因

使用長(zhǎng)春花CrBIS1基因在滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn搜索,結(jié)果獲得唯一1條bHLH基因序列,命名為GrbHLH1(轉(zhuǎn)錄組中基因編號(hào)：comp79308_c1)。根據(jù)花期滇龍膽中GrbHLH1基因和龍膽苦苷生物合成途徑基因的表達(dá)量進(jìn)行作圖,結(jié)果表明 GrbHLH1 基因與 GES、IS、IO、7DLGT基因的表達(dá)模式一致,即均在葉中表達(dá),而在根中不表達(dá)；同時(shí),GPPS、DL7H基因在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在根中的表達(dá)(圖1)。這些結(jié)果表明在葉片中 GrbHLH1 基因與 GES、IS、IO、7DLGT、GPPS、DL7H基因存在共表達(dá)現(xiàn)象,暗示著轉(zhuǎn)錄因子GrbHLH1可能通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)龍膽苦苷的生物合成。

圖1 滇龍膽GrbHLH1基因與龍膽苦苷生物合成途徑基因的共表達(dá)分析Fig.1 Co-expression analysis of the GrbHLH1 gene and genes in the gentiopicroside biosynthesis pathway in G.rigescens

2.2 滇龍膽GrbHLH1基因序列的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板,使用特異性引物擴(kuò)增出約1 200 bp的片段(圖2)。通過(guò)TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-GrbHLH1,再通過(guò)DNA測(cè)序方法獲得GrbHLH1基因序列。

圖2 滇龍膽GrbHLH1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：GrbHLH1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。Fig.2 PCR amplification result of the GrbHLH1 gene from G.rigescensM：MarkerⅢ；1：PCR amplification result of the GrbHLH1 gene.

2.3 GrbHLH1基因的生物信息學(xué)分析

利用Genetyx軟件對(duì)GrbHLH1基因的ORF序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示GrbHLH1基因編碼框全長(zhǎng)1 104 bp,編碼367個(gè)氨基酸。將該序列上傳至NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得的登錄號(hào)為KF941186.2。

進(jìn)一步使用Genetyx軟件將GrbHLH1基因的ORF序列翻譯成氨基酸序列,然后使用BLASTp軟件對(duì)GrbHLH1蛋白進(jìn)行序列相似性搜索,結(jié)果表明GrbHLH1與長(zhǎng)春花CrBIS1(44.07%)和CrBIS2(39.55%)、苜蓿 MtTSAR2(31.60%)和 MtTSAR1(25.15%)的相似性較高。使用DNAMAN軟件將GrbHLH1蛋白與長(zhǎng)春花CrBIS1和CrBIS2進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明GrbHLH1蛋白具有bHLH超家族保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。此外,利用MEGA軟件構(gòu)建Grb-HLH1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果顯示滇龍膽Grb-HLH1 蛋白與 CrBIS1、CrBIS2、MtTSAR1、MtTSAR2等IVa型bHLH蛋白處于同一進(jìn)化枝(圖4),表明它們親緣關(guān)系較近。

使用ProtParam軟件對(duì)GrbHLH1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明該蛋白質(zhì)單體的相對(duì)分子質(zhì)量為40.60 kD,理論pI為4.82；帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)為33,帶負(fù)電氨基酸殘基(Asp+Glu)為48,化學(xué)式為C1757H2856N478O588S16；不穩(wěn)定指數(shù)為55.80,屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為90.33,總平均疏水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.363,為親水蛋白質(zhì)。GrbHLH1蛋白含有20種基本氨基酸,其中亮氨酸和絲氨酸含量最高,均為10.40%；其次是天冬酰胺和蘇氨酸,分別為8.70%和7.90%；色氨酸含量最低,為0.50%。

利用SSpro軟件對(duì)GrbHLH1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明在該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(helix)占 18.53%,β 折疊(extended strand)占8.17%,環(huán)(loop)占73.30%。利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)GrbHLH蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖5所示。該模型以擬南芥MYC2蛋白[5gnj.3.B]為模板,在第189～244氨基酸處建模,三維模型覆蓋率為15%,序列一致性為57.14%。使用InterPro軟件對(duì)GrbHLH1蛋白進(jìn)行功能分析,結(jié)果表明該蛋白質(zhì)的分子功能為蛋白質(zhì)二聚化活性(GO：0046983)。

圖3 GrbHLH蛋白與長(zhǎng)春花bHLH蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果黑色：相似性等于100%；淺藍(lán)色：50%≤相似性＜75%；保守bHLH結(jié)構(gòu)域使用紅色框標(biāo)出；#：E盒/N盒特異性結(jié)合位點(diǎn)；*：同源二聚體界面的多肽結(jié)合位點(diǎn)。Fig.3 Multiple sequence alignment of the GrbHLH protein with bHLHs in Catharanthus roseusBlack：Homology=100%；Light blue：50%≤homology＜75%.Conserved bHLH motifs are indicated by red frame.#：E-box/N-box specific binding site；*：Polypeptide binding site of homodimer interface.

圖4 GrbHLH1蛋白與其他植物中bHLH蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic tree of the GrbHLH1 protein and bHLHs in some other plants

圖5 GrbHLH1蛋白同源二聚體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)紅色：α-螺旋；綠色：環(huán)。Fig.5 Prediction of three-dimensional structure of the GrbHLH1 homodimerRed：α-Helix；Green：Loop.

使用SignalP軟件對(duì)GrbHLH1蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽,表明該蛋白質(zhì)為非分泌型蛋白質(zhì)。利用TMHMM軟件預(yù)測(cè)GrbHLH1蛋白的跨膜螺旋區(qū),結(jié)果表明GrbHLH1蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域(圖6),屬于非膜蛋白質(zhì)。使用WoLF PSORT軟件對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示GrbHLH1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、高爾基體、細(xì)胞骨架的定位系數(shù)分別為 6、3、2、和 1。

圖6 GrbHLH1蛋白可能跨膜螺旋的檢測(cè)Fig.6 Detection of putative transmembrane helixes of the GrbHLH1 protein

使用ChloroP軟件對(duì)GrbHLH1蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明該蛋白質(zhì)無(wú)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。使用SMART軟件分析GrbHLH1蛋白的結(jié)構(gòu)功能域,結(jié)果表明在第191～240位氨基酸之間存在一個(gè)高度保守的HLH功能結(jié)構(gòu)域(圖7),該結(jié)構(gòu)域共由50個(gè)氨基酸組成,具有二聚化活性,位于二聚體界面的氨基酸位點(diǎn)有200～201、204～205、207～208、221、224、228、230～231、235、237～238(圖 3)。

對(duì)GrbHLH1基因進(jìn)行密碼子分析,結(jié)果表明該基因在大腸桿菌、畢氏酵母和釀酒酵母中表達(dá)的適應(yīng)指數(shù)分別為0.55、0.73和0.73,因此可選用大腸桿菌表達(dá)菌或酵母菌進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖7 GrbHLH1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.7 The conservative domain of GrbHLH1 protein

2.4 GrbHLH1基因的組織特異性表達(dá)分析

取兩年生滇龍膽的根、莖、葉和花,通過(guò)qPCR分析GrbHLH1基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明,該基因在葉中的表達(dá)量最高,其次是莖,再次是花；該基因在根中不表達(dá)(圖8)。

圖8 GrbHLH1基因在根莖葉花中的相對(duì)表達(dá)使用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差,數(shù)據(jù)來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。Fig.8 Relative expression of the GrbHLH1 gene in roots,stems,leaves and flowersExcel 2016 was used for statistical analysis.The standard deviations are represented by the error lines,and the data came from three independent repeated experiments.

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于地黃[23]、胡黃連[24]、川西獐牙菜[25]、滇龍膽[13]等藥用植物研究。隨之而來(lái)的問(wèn)題就是如何從海量數(shù)據(jù)中挖掘有用信息。基因共表達(dá)分析是挖掘基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型的一種方法。Miettinen等[6]利用基因共表達(dá)分析方法,從長(zhǎng)春花中挖掘出環(huán)烯醚萜生物合成途徑缺失的8HGO、IO、7DLGT和DL7H等4個(gè)基因。Patra等[26]采用基因共表達(dá)分析方法,在長(zhǎng)春花中發(fā)現(xiàn)了應(yīng)答茉莉酸的bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控單萜吲哚堿生物合成的網(wǎng)絡(luò)。已有的對(duì)長(zhǎng)春花、蒺藜苜蓿、青蒿和甘草的研究結(jié)果表明,bHLH轉(zhuǎn)錄因子在次生代謝調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[15,17～21]。本研究首先采用序列比對(duì)和共表達(dá)分析方法,從滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得1條GrbHLH1基因序列。然后對(duì)其進(jìn)行克隆和序列分析,結(jié)果顯示GrbHLH1蛋白與長(zhǎng)春花CrBIS1、CrBIS2蛋白在N末端和C末端相似性較低,在中間bHLH結(jié)構(gòu)域部分相似性較高(圖3),總體相似性分別為44.07%和39.55%,這表明GrbHLH1蛋白屬于bHLH超家族成員。研究表明bHLH蛋白的堿性區(qū)域與DNA結(jié)合有關(guān),而HLH區(qū)域參與二聚體的形成[27～28]。GrbHLH1蛋白與長(zhǎng)春花CrBIS1、CrBIS2蛋白在堿性區(qū)域具有相同的N盒或E盒特異性結(jié)合位點(diǎn)(圖3),表明它們具有相同的DNA結(jié)合機(jī)制；在HLH區(qū)域的高度相似,表明它們具有相似的二聚體形成機(jī)制。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示滇龍膽GrbHLH1蛋白與長(zhǎng)春花Cr-BIS1、長(zhǎng)春花 CrBIS2、苜蓿 MtTSAR1、苜蓿 MtTSAR2等IVa類(lèi)bHLH轉(zhuǎn)錄因子處于同一進(jìn)化枝(圖4)。研究表明IVa進(jìn)化枝的bHLH能夠調(diào)控植物活性萜類(lèi)化合物的生物合成[18],因此推測(cè)滇龍膽GrbHLH1是龍膽苦苷生物合成途徑的候選調(diào)控基因。此外,本研究使用WoLF PSORT軟件對(duì)GrbHLH1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)極可能定位于細(xì)胞核,與青蒿中調(diào)控青蒿素生物合成的AabHLH1蛋白的定位[7]一致,這為GrbHLH1轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

在各物種中,bHLH蛋白常見(jiàn)的活性形式為二聚體。在長(zhǎng)春花中,CrBIS2的活性形式為同源二聚體,但也能夠與CrBIS1形成異源二聚體發(fā)揮調(diào)控作用[29～30]。本研究中GrbHLH1蛋白的三維模型預(yù)測(cè)結(jié)果表明,該蛋白質(zhì)的活性形式也為同源二聚體(圖 5)。

在花期滇龍膽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中,GrbHLH1基因(comp79308_c1)在葉和根中的FPKM分別為6.07和0.15,表明該基因主要在葉中表達(dá)。在本研究中,針對(duì)生長(zhǎng)期GrbHLH1基因的組織特異性表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,該基因主要在葉中表達(dá),在莖和花中僅有少量表達(dá),而在根中不表達(dá)(圖8)。這些結(jié)果表明,在滇龍膽生長(zhǎng)期和花期,GrbHLH1基因主要在葉中表達(dá),因此推測(cè)GrbHLH1基因在生長(zhǎng)期和花期的葉片中均可調(diào)控龍膽苦苷的生物合成。

綜上可知,本研究為滇龍膽GrbHLH1基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。下一步將對(duì)GrbHLH1基因進(jìn)行原核表達(dá)、蛋白質(zhì)純化、抗體制備和DNA結(jié)合活性分析,以期為滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑調(diào)控機(jī)理的闡明奠定基礎(chǔ)。