甘藍型油菜EMS誘變矮稈突變體分析

李 昕,閻晉東,楊 飄,向芙江,張 維,彭武生,卓宇紅,李新梅,趙小英*

(1.湖南大學生物學院植物功能基因組學與發育調控湖南省重點實驗室,中國湖南長沙410082；2.湖南大學深圳研究院,中國廣東深圳518057；3.湖南亞華種業科學研究院,中國湖南長沙410001；4.長沙市豐景大地農業科技有限公司,中國湖南長沙410001)

油菜是我國最主要的油料作物之一,也是我國最主要的飼用蛋白質作物之一[1],屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)。甘藍型油菜(Brassica napus)是油菜中最重要的栽培種。常規的油菜品種植株較高,并且隨著甘藍型油菜雜交品種的廣泛推廣,油菜株高平均增加了20 cm以上[2]。高稈油菜倒伏后對油菜的生長發育影響很大,可導致減產15%～30%,嚴重時可達到60%以上[3]。油菜倒伏問題已經成為制約油菜機械化生產和產量提高的重要因素[4]。

植物矮稈基因資源的開發和創造是矮化品種選育的重要基礎。研究表明,許多植物的矮化突變與植物激素赤霉素(gibberellin,GA)和油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)有關,而少數植物的矮化突變與生長素(auxin)有關[5]。因此,植物矮稈基因也是研究植物激素生物合成和信號傳導及植物生長發育的重要資源[6]。目前,可通過自然變異、人工誘變、雜交和生物技術等方法來產生和培育植物矮稈突變體,從而獲得植物矮稈基因資源[4,6～9]。

課題組前期利用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)(0.8%)溶液處理甘藍型油菜玻里馬胞質雄性不育系(pol cms)的保持系2B種子,篩選獲得多個矮稈突變體,將其命名為Bnd1(Brassica napus dwarf 1)、Bnd2、Bnd3 等[10]。本研究對其中 Bnd2突變體的農藝性狀進行了分析；利用GA和BR對突變體進行處理,分析了突變體對植物激素的響應；同時,通過雜交對矮稈性狀進行了遺傳分析,為油菜矮稈突變體基因的定位克隆研究提供了線索。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用到的野生型油菜為甘藍型油菜玻里馬胞質雄性不育系(pol cms)的保持系2B,矮稈突變體Bnd2通過EMS誘變2B種子篩選獲得[10]。

1.2 田間種植與管理

2017年9月于湖南寧鄉關山油菜基地同時種植誘變親本2B、矮稈突變體Bnd2、2B與Bnd2的回交F1代和F2群體。對所有實驗材料進行點播育苗,待幼苗長出兩片真葉后,根據幼苗的大小進行分級移栽。試驗基地每小區寬2 m、長20 m、行距33 cm,每行種植10株。

1.3 農藝性狀鑒定

2018年4月,于油菜成熟期對矮稈突變體Bnd2的農藝性狀進行測量統計,包括株高、有效分枝高度、一次有效分枝數、主花序有效長度、主花序角果數、單株有效角果數、角果長度、每角粒數、節間距、伸長節數。隨后,收取矮稈Bnd2和親本2B植株各10株,自然風干,用于測量千粒重和單株產量。

1.4 矮稈性狀遺傳分析

2016年9月在湖南寧鄉關山油菜基地播種親本2B和矮稈突變體Bnd2。2017年3月以2B為母本、突變體Bnd2為父本進行回交,獲得回交F1代種子；5月份將F1代種子在青海加代繁殖,套袋自交獲得F2代種子。同年9月,在湖南寧鄉關山油菜基地播種親本2B、突變體Bnd2,以及F1和F2代種子,于次年成熟期測量株高。

1.5 植物激素處理

對外源激素赤霉素(GA3,購自國藥集團化學試劑有限公司)和油菜素甾醇(BR,購自美侖生物技術有限公司)設定不同的濃度梯度。GA3的濃度為0 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L。BR的濃度為0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L。取2B和Bnd2種子各30粒,置于同一鋪滿3層濾紙的培養瓶中,瓶中添加1/2 MS液體培養基10 mL(含不同濃度的GA3或BR),每個處理重復3次,播種7 d后測量各處理幼苗的下胚軸長度,并拍照。

1.6 數據分析

2 結果

2.1 矮稈突變體Bnd2的農藝性狀分析

對田間種植的親本和矮稈突變體油菜的農藝性狀進行統計分析,結果顯示,矮稈突變體Bnd2較誘變親本2B顯著變矮(圖1,表1)。其中,誘變親本2B的株高為168.2±7.61 cm；矮稈突變體Bnd2的株高為100.65±8.09 cm。同時,Bnd2的有效分枝高度(24.95±3.17 cm)、伸長節數(13.6±2.11)、平均節間距(6.55±1.46 cm)、主花序有效長度(52.91±7.72 cm)相對于誘變親本2B都明顯減少(表1),表明Bnd2株高降低主要是由于其有效分枝高度降低、伸長節數減少、節間距和主花序縮短。此外,Bnd2的主花序角果數、一次有效分枝數、每角粒數、角果長度、千粒重和單株產量也顯著低于2B,但單株有效角果數在兩者之間無顯著差異(表1)。

圖1 誘變親本2B和矮稈突變體Bnd2的植株表型(A)120 d苗齡的植株；(B)成熟期植株。圖中標尺均代表10 cm。Fig.1 Phenotypes of mutagenic parent 2B and dwarf mutant Bnd2(A)120-day-old plants；(B)Plants at maturity.Size bars in(A)and(B)represent 10 cm.

2.2 矮稈突變體Bnd2的矮稈性狀遺傳分析

為了確定矮稈突變體Bnd2的基因型,我們將誘變親本2B、矮稈突變體Bnd2以及2B和Bnd2的回交F1和F2代,同時播種在湖南寧鄉關山基地,于成熟期測量株高。株高的統計結果如圖2所示。親本2B的株高主要分布在150～169 cm(圖2A)；矮稈突變體Bnd2的株高主要分布在90～109 cm(圖2B)；回交F1代株高主要分布在135～144 cm(圖2C),偏向于高稈,說明矮稈突變體Bnd2為隱性突變。

F2代群體236個單株株高的統計結果如圖2D所示。從圖片數據可以看出,在2B和Bnd2回交F2代群體中株高發生了分離,呈明顯的雙峰分布。在拐點附近取臨界值110 cm進行卡方檢驗,結果發現群體中高稈與矮稈的分離比符合3︰1的理論值,表明Bnd2突變體的矮稈性狀受單基因控制,且為隱性突變。

2.3 矮稈突變體Bnd2幼苗下胚軸對外源GA、BR的響應

為了確認Bnd2突變體的矮化是否與GA和BR信號通路有關,我們檢測了Bnd2突變體幼苗下胚軸伸長對外源GA和BR的響應。將誘變親本2B和突變體Bnd2播種在含有不同濃度GA3或者不同濃度BR的1/2 MS培養基中,置于連續白光下培養,7 d后測量幼苗下胚軸的長度。從圖3可看出,Bnd2幼苗下胚軸比誘變親本2B的下胚軸要短,對GA3的響應減弱,并且GA3處理不能恢復Bnd2的表型(圖3A～C)；Bnd2突變體對BR的響應則增強,且BR可恢復Bnd2突變體幼苗的表型(圖3D～F)。根據這些研究結果,我們推測在Bnd2突變體中GA信號通路和/或者BR合成受到影響,這為后期基因定位克隆研究提供了線索。

表1 矮稈突變體Bnd2的農藝性狀統計Table 1 Agronomic characters of dwarf mutant Bnd2(±s)

表1 矮稈突變體Bnd2的農藝性狀統計Table 1 Agronomic characters of dwarf mutant Bnd2(±s)

注：PH,株高；BH,有效分枝高度；NPB,一次有效分枝數；LR,主花序有效長度；NSR,主花序角果數；NSP,單株有效角果數；LS,角果長度；NSS,每角粒數；MIL,平均節間距；NEI,伸長節數；TSW,千粒重；SYP,單株產量。：平均值；s：標準偏差；n=10；*：0.01＜P≤0.05,結果達到顯著水平；**：P≤0.01,結果達到極顯著水平。Notes：PH,plant height；BH,effective branch height；NPB,number of effective primary branches；LR,effective length of raceme；NSR,number of siliques on raceme；NSP,effective number of siliques per plant；LS,length of siliques；NSS,number of seeds per silique；MIL,mean internode length；NEI,number of elongated internode；TSW,thousand seed weight；SYP,seed yield per plant.：Mean；s：Standard deviation；n=10；*：0.01＜P≤0.05,the result reaches the significant level；**：P≤0.01,the result reaches the extremely significant level.

Mutagenic parent 2B Dwarf mutant Bnd2 Mutagenic parent 2B Dwarf mutant Bnd2 PH/cm 168.20±7.61 100.65±8.09**BH/cm 60.81±9.68 24.95±3.17**NPB 7.60±1.43 5.80±1.08*LR/cm 62.06±4.91 52.91±7.72*NSR 61.10±3.88 49.50±10.29*NSP 255.70±69.93 169.80±57.55 LS/cm 8.28±0.38 6.88±0.37**NSS 27.81±3.12 25.57±3.64**MIL/cm 8.60±0.71 6.55±1.46**NEI 19.70±1.85 13.60±2.11**TSW/g 3.36±0.08 2.67±0.18**SYP/g 18.81±6.15 9.13±1.98**

圖2 誘變親本2B(A)、突變體Bnd2(B)、回交F1代(C)及F2代(D)群體植株的株高頻率分布Fig.2 Plant height frequency distribution of mutagenic parent 2B(A),dwarf mutant Bnd2(B),backcross F1generation(C)and F2population(D)

3 討論

我國是世界上最大的油菜生產國,油菜種植面積占世界油菜總生產面積的1/3[11～12]。隨著雜交油菜的利用,油菜的品質得到顯著提高,但是雜交油菜的植株高大易倒伏,易造成油菜收獲指數的降低[2,13～14]。為了提高雜交油菜的抗倒伏性,科學家們通過誘變手段創制了一系列矮稈突變體。石淑穩等[15～16]利用EMS技術獲得了兩株矮稈植株,命名為DS-1和DS-2,株高分別為106 cm和95 cm。Wang等[17]通過EMS誘變獲得一個矮稈突變體Bndwf1,該突變體苗期葉片深綠,株高僅有80～110 cm,顯著低于野生型。本研究利用EMS處理甘藍型油菜保持系2B種子,篩選獲得矮稈突變體Bnd2,其株高為100.65±8.09 cm,顯著低于親本株高(表1)。遺傳分析結果表明Bnd2的矮稈性狀為隱性性狀,且受單基因控制(圖2),這為油菜抗倒伏育種提供了新的矮稈資源。

GA、BR和生長素是促進植物生長、控制株高的重要激素。目前,已報道的油菜矮稈突變體的矮化大多數與GA或者生長素信號減弱有關[5,18～23]。Liu等[18]研究發現ds-1半矮稈突變體的DS-1基因編碼GA信號抑制子BnaA06.RGA,在突變體中該蛋白質VHYNP模體中保守的脯氨酸(pro)突變為亮氨酸(leu)。Zhao等[19]鑒定到一個與ds-1表型相似的半矮稈突變體ds-3,DS-3基因也編碼一個在GA信號途徑中起抑制作用的DELLA蛋白(BnaC07.RGA),并且與BnaA06.rga-ds突變位點一樣,BnaC07.rga-ds的保守區域VHYNP中發生了一個相同的氨基酸替換(脯氨酸突變為亮氨酸),導致GA信號途徑受阻,植株矮化。另外,Li和Zeng等[20～21]分別鑒定到的矮稈突變體NDF-1與bnaC.dwf,都是GA不敏感型突變體,其中NDF-1矮化是由于GA受體BnGID1的編碼基因啟動子發生突變,導致基因表達降低,從而使GA信號減弱；而bnaC.dwf突變體受一對隱性基因控制,株高對外源赤霉素處理不敏感,但酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)結果表明,突變體葉片與莖中內源赤霉素含量顯著高于野生型T6(+/+),說明該突變體在GA信號轉導途徑中存在缺陷,但控制該性狀的候選基因目前尚未確定。最近,Cheng等[22]通過組織培養獲得一個矮稈突變體G7,該突變體中Bna.IAA7.C05基因所編碼蛋白質的保守區域GWPPV突變為EWPPV,使得生長素響應相關基因的表達下調,從而導致植株變矮。Li等[23]鑒定了一個EMS誘變的功能獲得型半矮稈突變體sca,進一步的研究發現,SCA基因編碼生長素信號負調控因子Aux/IAA(BnaA3.IAA7),在突變體中該蛋白質第84位甘氨酸(G)突變為谷氨酸(E),突變蛋白質的穩定性增加,使得生長素信號受到抑制,從而使植株矮化。本研究發現,Bnd2突變體幼苗下胚軸對GA的響應減弱,對BR的響應增強,而且BR可以恢復突變體幼苗下胚軸的表型(圖3),因此推測在Bnd2突變體中GA信號和/或者BR合成受到影響。后期對該突變位點的定位克隆,將對闡明GA/BR調控油菜株型和生長發育的機制,以及培育矮稈油菜品種具有重要意義。

圖3 矮稈突變體Bnd2幼苗下胚軸的伸長生長對外源GA3和BR的響應(A)對照組(-GA)及10-4mol/L GA3處理組(+GA)的2B與Bnd2幼苗表型；(B)不同濃度GA3處理后2B和Bnd2的下胚軸長度；(C)不同濃度GA3處理后2B和Bnd2中下胚軸長度與對照組(0 mol/L)下胚軸長度的比值；(D)對照組(-BR)及10-5mol/L BR處理組(+BR)的2B與Bnd2幼苗表型；(E)不同濃度BR處理后2B和Bnd2的下胚軸長度；(F)不同濃度BR處理后2B和Bnd2中下胚軸長度與對照組(0 mol/L)下胚軸長度的比值。圖(B)～(C)與(E)～(F)的數據代表平均值±標準差,n=20；*：0.01＜P≤0.05,結果達到顯著水平；**：P≤0.01,結果達到極顯著水平。圖(A)、(D)中的標尺均代表10 mm。Fig.3 Responses of hypocotyl elongation of dwarf mutant Bnd2 seedlings to exogenous GA3and BR(A)Phenotypes of 2B and Bnd2 seedlings in control group(-GA)and treatment group with 10-4mol/L GA3(+GA)；(B)Hypocotyl lengths of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of GA3；(C)Ratio of hypocotyl length of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of GA3to that of the control group(0 mol/L)；(D)Phenotypes of 2B and Bnd2 seedlings in control group(-BR)and treatment group with 10-5mol/L BR(+BR)；(E)Hypocotyl lengths of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of BR；(F)Ratio of hypocotyl length of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of BR to that of the control group(0 mol/L).Data shown in(B)～(C)and(E)～(F)are represented as mean ± SD,n=20；*：0.01＜P≤0.05,the result reaches the significant level；**：P≤0.01,the result reaches the extremely significant level.Size bars shown in(A)and(D)are represented as 10 mm.