2019冠狀病毒病(COVID-19)實驗室診斷方法的應用現狀

楊 杰,曾凡勝,秦志強,2*

(1.益陽醫學高等專科學校益陽市洞庭湖區血吸蟲與病原生物控制技術重點實驗室,中國湖南益陽413002；2.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所世界衛生組織熱帶病合作中心科技部國家級熱帶病國際聯合研究中心國家衛生健康委寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室國家熱帶病研究中心,中國上海200025)

自2019年12月起,湖北省武漢市出現多起不明原因病毒性肺炎病例。2020年1月,多位研究人員通過分離病原體并開展基因組序列測定,發現了一種能感染人的新型冠狀病毒[1～2]。2020年2月11日,國際病毒分類委員會正式將該新型冠狀病毒命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe scute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),世界衛生組織將該病毒引起的疾病稱為2019冠狀病毒病 (corona virus disease 2019,COVID-19)。COVID-19傳染性很強,短時間內就由武漢傳播至周邊地區并很快蔓延到全國。根據國家衛生健康委員會官方網站發布的疫情數據,截至2020年4月19日,我國累計報告確診病例82 747例,累計死亡病例4 632例,累計治愈出院病例77 084例,多省病例數持續清零,表明中國疫情控制取得了階段性勝利[3]。然而,全球多國已發生新型冠狀病毒肺炎疫情,鑒于全球COVID-19病例的持續增多[4～7],2020年3月11日,世界衛生組織宣布2019冠狀病毒病疫情已構成全球大流行。截至2020年4月19日,全球COVID-19確診病例累計逾224萬例,累計死亡病例超過15萬例[8]。當前,國家衛生健康委員會已經推出了第七版新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案,旨在為現階段臨床救治COVID-19患者提供規范化的操作指南[9]。實驗室檢測是診斷COVID-19的重要手段,現階段COVID-19實驗室檢測方法包括病原學方法、血清學檢查以及一般檢查。

1 病原學方法

目前,病原學方法主要是基于SARS-CoV-2核酸檢測的方法,包括基因組測序與實時逆轉錄PCR等。

1.1 基因組測序

在2019年12月中國武漢市發現多例未知病毒感染性肺炎病例后,Lu等[10]對來自9名住院患者的支氣管肺泡灌洗液和病毒分離培養樣品進行了基因組測序,分別獲得了完整的或部分的SARS-CoV-2基因組序列。通過分析發現SARSCoV-2與2018年在中國東部舟山采集的兩種蝙蝠源性SARS樣冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的同源性達88%,而與SARSCoV(約79%)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)(約50%)的同源性相差較遠。基因組測序為疫情傳播早期武漢不明原因的病毒性肺炎病例的病原體鑒定提供了有力保證,為后續診斷試劑的研發以及臨床救治工作的開展提供了寶貴的參考。為維護全球公共衛生安全,中國已與世界衛生組織分享在武漢發生的新型冠狀病毒的基因序列信息,目前SARS-CoV-2序列已共享至中國科學院新型冠狀病毒肺炎科研文獻共享平臺(中英文版)、新型冠狀病毒國家科技資源服務系統、病毒基因組自動化鑒定云平臺(VCI)等數個公共醫學信息平臺。雖然基因組測序診斷COVID-19的準確度高,但因測序所需儀器昂貴,所需時間較長,因此不適用于臨床快速、大批量的診斷。

1.2 實時逆轉錄PCR

實時逆轉錄PCR(quantitative real-time RTPCR,RT-qPCR)在檢測SARS-CoV-2感染方面具有特異性強、準確度較高等特點,并可檢測出多數無相關臨床癥狀的無癥狀感染者[11～14],現已被推薦為SARS-CoV-2感染確診的金標準。RT-qPCR的檢測原理一種是借助嵌入式染料(如SYBR Green)與PCR過程中產生的DNA結合,實現對PCR產物的實時檢測；另一種則通過熒光標記探針進行實時檢測。研究結果顯示,SARS-CoV-2感染者痰液、咽拭子、血液、糞便標本中核酸擴增實驗的陽性率不同。通過RT-qPCR實驗比較SARS-CoV-2感染者的痰液、糞便、血液樣品發現,痰液樣品的陽性率最高[15～16]。而 Xie等[17]使用 3 種不同的 RT-qPCR試劑盒比較了口咽拭子和糞便樣品中SARS-CoV-2核酸擴增測試的陽性比率,發現在19例患者中,9例經口咽拭子樣本檢測為SARSCoV-2感染,8例糞便樣本檢測呈病毒核酸陽性,糞便和口咽拭子檢測的陽性率相近。通常,血液中陽性檢出率較低,僅10%的急性期患者血液樣本中可檢測到病毒核酸[16]。上述統計數據表明,現有RT-qPCR檢測方法可能存在漏檢的問題。基于此,Chan等[18]開發了一種新的核酸檢測方法——COVID-19-RdRp/Hel檢測法,是針對SARS-CoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)/解旋酶(Hel)、刺突(S)和核衣殼(N)基因的RT-qPCR方法,與在超過30個歐洲實驗室中使用的RdRp-P2測定法相比,陽性率提高了15.4%(P＜0.001)。不斷改進的RT-qPCR方法為SARS-CoV-2感染的確診提供了更加準確的檢測手段。

此外,患者不同標本的RT-qPCR檢測可以輔助分析病毒感染的進程。Chen等[19]通過RT-qPCR檢測已確診病人血液和肛門拭子中的病毒存在情況,發現6例(6/57)血液標本中可檢測到病毒RNA的患者均已發展為重型COVID-19,表明血清病毒RNA與疾病嚴重程度密切相關；11例(11/28)肛門拭子病毒陽性患者中有8例處于重型臨床階段；同時,患者肛門拭子中的病毒RNA濃度高于血液,這表明該病毒可能在消化道中復制。Ling等[20]發現與患者口咽拭子相比,患者糞便中病毒RNA的清除速度較慢,中位延遲數為2.0(1.0～4.0)d。因此,在恢復期患者的糞便中監測病毒RNA非常重要。

綜上分析可知,患者不同標本的RT-qPCR檢測對SARS-CoV-2感染確診及分析病毒感染進程具有重要作用,且RT-qPCR臨床檢測普及率較高,目前仍是SARS-CoV-2感染確診不可替代的金標準。

1.3 巢式RT-PCR

巢式RT-PCR(nested RT-PCR)是利用兩套PCR引物(巢式引物)進行兩輪PCR擴增反應,其敏感性及準確性與RT-qPCR相似[21～23]。巢式RTPCR廣泛應用于多種呼吸道病毒的臨床檢測。Wu等[24]利用巢式RT-PCR方法對30例SARS患者和9例對照患者的全血標本進行了SARS-CoV檢測,發現巢式RT-PCR檢測SARS-CoV的特異性和敏感性分別為100%和83%。Yu等[25]開發的巢式RT-PCR方法可同時鑒定包括人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)在內的12種呼吸道病毒。2020年,Shirato等[26]開發了兩種巢式RT-PCR分析方法和兩種RT-qPCR方法,并將它們一起用于SARS-CoV-2感染者檢測。截至2020年2月8日,該套方法已成功檢測出日本25例陽性感染病例。巢式RT-PCR可作為RT-qPCR方法的補充,以提高COVID-19臨床檢測的準確性。

1.4 生物芯片檢測

恒溫擴增芯片法是在恒溫(65℃)條件下利用具有鏈置換功能的聚合酶進行反應,使用熒光染料摻入法進行實時熒光檢測,陽性樣品在分析儀中會產生和實時熒光類似的S形擴增曲線。目前,人們已開發多種基于智能手機平臺的恒溫擴增檢測法,使用簡便,具有較高的實用性[27～28]。康蓓佩等[29]利用恒溫擴增芯片法檢測了常見的13種下呼吸道病原體,與普通培養法相比,該方法的檢出率較高；而且,檢測時間縮短為2～2.5 h,具備快速診斷的能力。據報道,程京團隊開發的“六項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒(恒溫擴增芯片法)”,能在1.5 h內檢測包括SARS-CoV-2在內的6項呼吸道病毒核酸,并可快速區分COVID-19和其他呼吸道疾病[30]；朗道實驗室利用生物芯片陣列技術(Biochip Array Technology)新開發了可針對SARSCoV-2和SARS-CoV、MERS-CoV等其他9種呼吸道病毒的綜合性檢測技術[31]。總之,多種高敏感性生物芯片檢測技術的開發為COVID-19確診提供了可靠快捷的篩查方法。但是生物芯片檢測技術難度和設備要求較高,目前普及率也不高,因此不適用于臨床大批量的診斷。

1.5 逆轉錄環介導等溫擴增法

當前,中國防控COVID-19的重點已由控制境內病例轉向防控境外輸入。境外輸入人員的病毒檢測工作量較大,時間要求緊,因此防控境外輸入需要開發一種可以在現場快速完成篩查的診斷試劑。逆轉錄環介導等溫擴增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP)是在63℃等溫條件下,一步進行RNA逆轉錄和核酸擴增的方法。Yang等[32]在預印本平臺medRxiv發表文章指出,其團隊開發的RT-LAMP法可同時檢測SARS-CoV-2的ORF1ab基因、E基因和N基因,且測定的靈敏度與RT-qPCR相似,所檢測的208個臨床標本的特異性為99%。RT-LAMP法的優點在于不需要昂貴的設備,可在30 min內快速獲得結果。所以,RT-LAMP法具有協助進行入境口岸潛在感染者篩查工作的潛力。

1.6 逆轉錄數字PCR

我國COVID-19確診病例已逐步減少,現階段COVID-19無癥狀感染者是否會引起疫情反彈的問題備受關注。COVID-19無癥狀感染者的定義為無臨床癥狀,呼吸道等標本SARS-CoV-2病原學檢測陽性者[9]。據統計,COVID-19無癥狀感染者從醫學觀察開始至SARS-CoV-2核酸檢測陽性的時間為1～18 d,平均6.0 d,核酸檢測存在“窗口期”,且需要多次采樣檢測[33]。如果能通過敏感性更高的檢測方法縮短COVID-19無癥狀感染者病毒核酸檢出陽性的時間,做到“早發現、早診斷、早治療”,對疫情防控工作將具有重要意義。逆轉錄數字PCR(reverse transcription digital PCR,RT-dPCR)是基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量,可直接計數出DNA分子的個數,是靈敏度極高的絕對定量方法。Dong等[34]在medRxiv發文指出,對于103例發熱疑似病例,SARS-CoV-2檢測的敏感性從RT-qPCR的28.2%提升到RT-dPCR的87.4%；RT-dPCR的總體敏感性、特異性和診斷準確性分別為90%、100%和93%；而且,RT-dPCR檢測極靈敏,檢測限僅為2個拷貝/反應。由此可知,RT-dPCR適用于低病毒載量的無癥狀感染者標本檢測。

2 血清學檢查

2.1 特異性IgM、IgG抗體檢測

隨著核酸檢測漏檢問題的發現,臨床迫切需要可以彌補核酸漏檢的其他檢測方法。SARSCoV-2感染后機體會產生特異性抗體。IgM是機體初次免疫應答最早產生的抗體,隨后機體產生IgG抗體。有研究指出COVID-19癥狀發作5.5 d后,IgM酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的檢測效率高于RT-qPCR方法。將IgM ELISA檢測與RT-qPCR結合使用時,每位患者的陽性檢出率提高至98.6%,顯著高于單次RT-qPCR檢測的檢出率51.9%[35]。由于COVID-19發作10 d后患者血清IgM的陽性率明顯增加[36],所以IgM ELISA適用于COVID-19發作10 d后患者血清樣品的檢測。白少麗等[37]的調查結果顯示,在聚集性發病的7例COVID-19患者中,特異性IgM抗體陽性者占5例；而且在該聚集性發病群體中,有4例患者無癥狀,但核酸檢測結果和IgM抗體檢測結果均為陽性。該結果表明特異性IgM抗體篩查對于早期發現和早期隔離無癥狀感染者也非常重要。但是,IgM抗體篩查同樣存在檢測結果假陰性、敏感度不夠高的問題。Li等[38]開發了一種快速簡單的即時側向流動免疫測定法,該方法可以在15 min內同時檢測人血中針對SARS-CoV-2病毒的IgM和IgG抗體,從而可以檢測出處于不同感染階段的患者。使用397個RT-qPCR確診的COVID-19患者和128個SARSCoV-2陰性的對照個體的血液樣本來測量該方法的臨床檢測靈敏度和特異性,結果顯示總體測試的靈敏度為88.66%,特異性為90.63%。此外,研究者評估了從不同類型的靜脈和指尖血液樣本獲得的臨床診斷結果,發現在指尖血液、血清和靜脈血血漿各樣品之間具有很高的IgM和IgG抗體檢測一致性。總的來講,與單次IgM或IgG測試相比,IgM-IgG聯合檢測具有更好的實用性和敏感性。它可以用于醫院、診所和測試實驗室中有癥狀或無癥狀SARS-CoV-2攜帶者的快速篩查。

2.2 白細胞介素-6檢測

經臨床初步觀察,COVID-19重癥患者存在白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和 γ-干擾素(interferon gamma,IFN-γ)等促炎性細胞因子的顯著升高,表現出細胞因子風暴的特征[39]。IL-6是免疫系統在應對損傷和感染的最初反應中所表達的重要細胞因子,在急性炎癥反應中IL-6處于核心地位,IL-6的升高處于細胞因子啟動的非常早期,而且持續時間長,因此可用來輔助急性感染的早期診斷。Huang等[40]系統闡述了COVID-19的臨床特點,通過對患者外周血的多因子檢測分析發現重癥監護病房(intensive care unit,ICU)患者的IL-6水平顯著高于對照組。Zhou等[41]發現新型冠狀病毒感染后,迅速激活病原性T細胞,產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-6等細胞因子。GM-CSF會進一步激活CD14+、CD16+炎癥性單核細胞,產生更大量的IL-6和其他細胞因子,從而形成細胞因子風暴,導致肺部和其他器官的免疫損傷。上述結果證明IL-6是引發COVID-19患者炎癥風暴的關鍵因子。因此,IL-6具有成為細胞因子風暴中預警、監測和預后的生物標志物的潛力。在國家衛生健康委員會辦公廳和國家中醫藥管理局辦公室2020年2月14日聯合發布的“關于印發新型冠狀病毒肺炎重型、危重型病例診療方案(試行第二版)的通知”中,已經明確將IL-6進行性上升作為病情惡化的臨床警示指標,需對重癥患者及時監控。

3 一般檢查

外周血一般檢查是醫院常規的檢測項目,通過監測生化指標變化輔助早期診斷疾病以及判斷預后。多項研究觀察了COVID-19患者存在的生化指標變化。通過對研究結果的總結發現,多數患者外周血中的淋巴細胞計數減少,白細胞總數正常或減少,部分患者可出現嗜酸性粒細胞和CD8+T淋巴細胞減少[42～43],提示嗜酸性粒細胞減少癥和淋巴細胞減少可能是COVID-19診斷的潛在指標。此外,多數重癥患者C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)和血清乳酸脫氫酶(serum lactate dehydrogenase,LDH)顯著升高；部分重癥患者白蛋白(albumin,ALB)降低,降鈣素原正常[44～45],提示 ALB降低和CRP、LDH升高可能是COVID-19嚴重程度的預測指標。需要指出的是,一般檢查項目的特異性不高,只能作為COVID-19輔助診斷或判斷預后的參考指標,不能單獨用于確診。

自疫情發生以來,各種實驗室診斷方法已快速發展并在臨床診斷得以應用,現有的關于COVID-19的實驗室診斷方法的優點和缺點的總結見表1。

4 討論

快速、準確診斷對于COVID-19的精準治療非常關鍵。當前,批準上市的新型冠狀病毒肺炎檢測試劑主要包括兩類,一類是核酸檢測試劑,一類是抗體檢測試劑。核酸檢測是COVID-19臨床診斷主要的檢測手段,其平均檢測時間為2～3 h,特異性強、靈敏度較高。但是當前廣泛應用的核酸檢測方法存在一定缺陷。1)漏檢問題。相關報道指出,通過鼻咽拭子篩查出新型冠狀病毒陽性的患者中有35%在第1天通過口咽拭子檢測的結果為陰性,導致在低度感染者的咽拭子中難以查見病原體,從而影響確診[46]；2)文獻報道14%的兩次核酸檢測陰性的出院患者出現“復陽”的現象,給COVID-19的防治帶來新的問題[47]。上述核酸檢測漏檢或者出院后“復陽”現象的原因可能與樣本采集、病毒在人體排毒時期、試劑質量以及實驗者操作等因素相關。血清抗體檢測能從另一個維度來反映病毒感染的情況,是對病毒核酸檢測的有效補充。血清特異性IgM和IgG陽性,或恢復期特異性IgG抗體滴度較急性期升高4倍及以上,可作為核酸檢測陰性疑似病例的診斷依據[9]。但是,抗體檢測存在窗口期,相對核酸檢測要滯后幾天到幾周,而且有些體液免疫功能偏弱的患者體內產生的抗體含量較低,容易造成抗體檢測假陰性,因此抗體檢測不能完全替代核酸檢測方法。

針對目前臨床的核酸診斷所出現的問題,建議從以下幾方面予以加強：一是加強聯合方法的應用,比如出院時增加特異性抗體指標的測定。多項研究結果表明,血清學抗體檢測與核酸檢查同時使用可以提高SARS-CoV-2檢測陽性率[48～49]。而且,結合抗體和核酸檢測可以幫助分析病毒感染的進程。例如：檢測出SARS-CoV-2特異性IgM抗體且核酸檢測陽性,提示是早期感染；如果IgG抗體含量較高且核酸陰性,表明存在感染并已獲得一定的免疫保護；二是為了彌補采集鼻咽拭子和口咽拭子引起受試者惡心、咳嗽等不適感的不足,建議開辟SARS-CoV-2感染診斷的新途徑。相關文獻報道,COVID-19病人糞便樣本中的SARSCoV-2核酸檢測同樣較準確[50],有的患者雖然14次口咽拭子和鼻咽拭子的核酸檢測呈陰性,但最后糞便拭子的檢測結果卻是陽性[51]。尿液是一種方便快捷的取樣方式,但目前尿液中病毒核酸檢出率較低,僅6.9%[20]。羅格斯大學旗下RUCDR Infinite Biologics開發了一種主要通過唾液檢測SARS-CoV-2的新型檢測方法。通過采集60名COVID-19患者的唾液和拭子樣本來測試該方法的準確性,發現病人唾液樣本的檢測結果與拭子的結果100%吻合[52]。基于糞便、唾液和尿液的取樣途經簡便、快速且無創,若能進一步提高其檢出率,則可彌補現有的取樣方法的不足；三是繼續開發新的SARS-CoV-2檢測技術。有研究組運用高分辨率質譜設備取得了COVID-19輕重癥患者血清樣本的蛋白質組和代謝組譜圖,發現了一系列生物標志物,這有望為預測輕癥患者向重癥發展提供導向[53]。Broughton等[54]開發了一種基于CRISPR-Cas12的側向流動檢測技術,該檢測技術可快速(＜40 min)從呼吸道拭子的RNA提取物中檢測SARS-CoV-2。使用36例COVID-19患者和42例其他呼吸道病毒感染的患者對該方法進行驗證,發現陽性預測率達95%,陰性預測率達100%。基于CRISPR的DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted Crispr Trans Reporter)測定法為RT-qPCR法提供了直觀、快速的替代方法；四是需要加強臨床診斷檢測試劑的標化問題。迄今為止,國家藥品監督管理局已應急審批通過了23款新型冠狀病毒檢測試劑盒,其中15款屬于新型冠狀病毒核酸檢測試劑,8款屬于膠體金法抗體檢測試劑。但這些試劑質量依然存在批間差異和不夠穩定的問題,郭元元等[55]選取了6種核酸檢測試劑對COVID-19弱陽性樣品進行檢測,發現部分試劑的準確性、靈敏度、重復性欠佳。因此,建議國家有關部門盡快開展COVID-19診斷試劑的質量評價,可通過制備參考物質(如核酸、血清)開展實驗室室間比對,遴選出公認的優良的檢測試劑,進而推廣應用。

表1 COVID-19實驗室診斷方法Table 1 Laboratory diagnosis for COVID-19

如前所述,雖然我國在COVID-19疫情防控方面取得了階段性成效,但是隨著COVID-19疫情在全球的不斷擴散,我國輸入病例明顯增多,目前我國疫情防范仍處于緊張態勢。現階段我們仍需要精準防控,精準防控的關鍵是需要精準診斷。我們期待將來的檢測產品較之前檢測產品在檢測時間上有明顯的縮短,檢測的結果也更為精準、客觀,為COVID-19的臨床診治以及大規模的人群流行病學調查提供更為適宜的診斷工具。