NIPT高風險胎兒的染色體核型分析及染色體微陣列的結果分析

潘璐，劉艷秋，王欣榮，饒慧華，陸清

（江西省婦幼保健院產前診斷中心，南昌 330006）

我國是出生缺陷高發國家，總發生率約5.6%，然而染色體非整倍體異常是導致出生缺陷最常見的原因之一，主要涉及的染色體有21、18、13 及性染色體等，目前無有效的治療方法，只能通過產前篩查和產前診斷來預防此類患兒出生。因此尋求一種安全、簡單、經濟、實用的產前篩查方法，來降低出生缺陷具有重要意義。隨著分子生物學技術的不斷發展，NIPT 是基于母體外周血中含有胎兒游離DNA 的基礎上發展起來的一種檢測技術[1]，目前NIPT 以其無創性、高敏感性和特異性等優勢逐漸受到孕婦及婦產科醫生的青睞。本研究通過染色體核型分析和染色體微陣列檢測 （CMA）對NIPT 結果為高風險的胎兒進行驗證，總結NIPT高風險進行介入性產前診斷的符合率情況，并為遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016 年 1 月-2019 年 12 月因無創產前檢測（NIPT）結果高風險來我院產前診斷中心進一步行介入性產前診斷的孕婦共981 例，其中雙胎妊娠有5 例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 對NIPT 高風險孕婦進行優生遺傳咨詢，告知、簽署知情同意書，在無菌條件、B 超引導下經腹羊膜腔穿刺術或者臍靜脈穿刺術采集羊水或臍血標本進行產前診斷，羊水抽取30ml，臍血抽取2-3ml。

1.2.2 染色體制備 將抽取的羊水于離心管中離心,去除上清液后將剩下的沉淀接種于細胞培養瓶中，放置于37%CO2培養箱中靜止培養7-8d 觀察換液，次日加入秋水仙素后繼續培養4h，常規收獲、制片、G 顯帶（320-400 條帶）。臍帶血常規接種培養 3d 后收獲、制片、G 顯帶（320-400 條帶）。每份標本至少計數20 個分裂相，分析5 個核型。嵌合體至少計數50 個核型。

1.2.3 染色體微陣列檢測 （CMA） 采用QIA-GEN公司生產的Qiamp DNA Blood Mini Kit 進行DNA提 取,使 用 Affymetrix Cytoscan 750K （ 美 國Affymetrix 公司）芯片（約75 萬個探針位點）進行拷貝數變異檢測，操作步驟嚴格按照說明進行，由Affymetrix@ Chromosome Analysis Suite 2.0(ChAS 2.0)軟件對芯片進行數據掃描和分析。

2 結果

2.1 NIPT 與染色體核型分析結果對比 981 例NIPT 高風險中染色體核型分析檢出異常587 例，陽性率59.84%； 其中21-三體的陽性率最高，為81.69%；13-三體的陽性率最低，為 27.08%。見表1。5 例雙胎妊娠中，其中2 例雙胎均為21-三體綜合征，2 例雙胎均為18 三體綜合征，另一雙胎其中一胎為21-三體綜合征，另一胎染色體核型正常。NIPT 異常分類情況與染色體核型結果相比較，除外假陽性，有13 例存在不一致情況。見表2。

表1 NIPT 高風險的胎兒染色體核型異常結果及陽性率

表2 NIPT 異常分類與染色體核型分析不一致情況

2.2 染色體微陣列（CMA）結果 394 例染色體核型分析結果正常的胎兒中，通過染色體微陣列（CMA）檢測，發現 41 例結果異常，且與 NIPT 提示異常不相符的有10 例，另有2 例染色體核型分析發現為標記染色體，通過CMA 檢測明確了標記染色體來源。見表3。

3 討論

每年中國出生的新生兒大約有1600 萬，其中因染色體疾病而導致的出生缺陷人數為約為0.6%（9.6 萬）[2]，因此人類在不斷研究和探索新的技術來防控出生缺陷。近年來，NIPT 技術在臨床上已廣泛開展來篩查胎兒染色體非整倍體異常，它具有較高的敏感度和特異性，但仍存在一定的假陽性和假陰性的情況，因此目前它僅可作為產前篩查方法，尚不能作為產前診斷方法。本研究發現，NIPT 高風險的孕婦進一步行介入性產前診斷的陽性率分別為 21-三體 81.69%（290/355）、18-三體73.84%（96/130）、13-三體 27.08%（13/48）、性染色體 56.92%（148/260）、其他染色體 21.28%（40/188），與既往報道研究的結果有差異，但基本上21-三體的陽性率最高約81.12%～97.60%，性染色體陽性率為35.29%～71.40%。本研究中的21-三體、性染色體這兩類異常的數目較多，因此與既往文獻報道的差異不大[3,4]，18-三體、13-三體這兩類異常研究數目較少，與既往報道的有差異。

表3 染色體微陣列檢測（CMA）陽性結果

NIPT 存在一定的假陽性情況，主要原因有限制性胎盤嵌合[5,6]，孕婦自身體細胞染色體嵌合[7,8]或存在拷貝數變異[9]，孕婦接受過輸血、器官移植、免疫治療、罹患腫瘤[10]以及雙胎之一胚胎停育[11]等。本文研究中有13 例NIPT 異常分類與染色體核型結果不一致，可能與胎盤嵌合及不同胚層的染色體嵌合有關，因此對于NIPT 假陽性的情況需進一步通過染色體核型分析來確診。

在NIPT 檢測中雙胎妊娠屬于慎用人群，因此選擇NIPT 進行產前篩查需謹慎[12]，但目前有一些研究發現NIPT 對雙胎妊娠仍有較好的檢出率[13,14]。本文中的 5 例雙胎妊娠，其中 3 例 NIPT 提示21-三體高風險，另2 例提示18-三體高風險，通過染色體核型分析發現21-三體高風險中兩個雙胎均為21-三體綜合征，另一個雙胎其中一胎為21-三體，另一胎核型正常；18-三體高風險中2 個雙胎均為18-三體綜合征，說明雙胎妊娠選擇NIPT產前篩查具有一定的臨床應用價值，鑒于研究例數較少，尚不能明確NIPT 在單胎和雙胎妊娠中產前診斷符合率的差異情況。

NIPT 除可篩查常見的 21、18、13 號染色體非整倍體及性染色體外，在提示其他染色體微缺失、微重復也發揮重要作用。本研究中，NIPT 提示其他染色體異常188 例，通過核型分析發現40 例異常，陽性率21.28%。另有研究表明染色微缺失、微重復在母體染色體正常的胎兒中發生率可達1～1.7%[15]，與孕婦的年齡沒有相關性。傳統的染色體核型分析 G 顯帶（320-400 條帶）可發現 5～10M 以上的缺失、重復，CMA 是一種全新的分子核型分析技術，能夠檢出100kb 以下的CNVs（拷貝數變異），從而進一步檢測出染色體微缺失或者微重復所涉及的基因、發生位置及片段大小[16]，通過CMA 檢測，先天性多發畸形、認知障礙性疾病、孤獨癥患兒等出生缺陷病因檢出率提高15-20%[17,18]。本文394 例染色體核型分析結果正常的胎兒中，通過CMA 檢測，發現41 例結果異常，檢出率提高10.4%，其中有2 例NIPT 提示22 號染色體部分重復，核型分析分別為47,XN+mar[7]/46,XN[38]；47,XN+mar[15]/46,XN[25]嵌合型，標記染色體來源不明，通過CMA 發現該標記染色體分別為22q11.1q12.1嵌合重復，比例20%；22q12.1q13.2 嵌合重復，比例38%。目前多中心研究認為，NIPT 高風險或者染色體核型正常，如存在超聲異常根據相關指南應建議進一步進行CMA 檢測[19]。因此對于NIPT 異常的孕婦，推薦選擇核型分析和CMA 聯合檢測，防止漏診那些微小片段的缺失和重復。此外，CMA 還可檢測出標記染色體來源。

綜上所述，隨著分子生物學的發展，NIPT 作為產前篩查的一種新的技術，具有較高的敏感性和特異性，但檢測同時具有局限性，存在假陽性和假陰性的問題,需要大樣本的數據來進一步優化和改進。因此對于NIPT 高風險的孕婦，仍需進一步行介入性產前診斷通過染色體核型分析和染色體微陣列檢測來確診[20],提高染色體異常疾病的檢出率,達到降低出生缺陷發病率，提高人口素質的目的。