甘膽酸試劑盒性能評估

任愛武 杜娟

北京協和醫院檢驗科

血清甘膽酸是膽酸和甘氨酸結合成的結合型膽酸之一，在肝細胞里面，膽固醇經過特別復雜的酶促反應，轉變為初級膽汁酸。其中有膽酸和鵝去氧膽酸。膽酸的類固醇核上面有三個羥基(C3、C7、C12），側鏈末端的羥基以肽鍵和甘氨酸結合而成。血清甘膽酸正常的代謝途徑是腸―肝循環，血清甘膽酸由肝細胞合成，通過毛細膽管、膽管排進膽囊，隨著膽汁進入十二指腸，幫助食物進行消化。95%的膽酸在回腸末端被重吸收，經過門靜脈再回到肝臟，被肝細胞攝取后再利用。在血清中以蛋白結合形式為主而存在，溢入體循環的總量小于1 %。在正常情況下,外周血中膽酸含量甚微極其少,正常成人不管是空腹還是餐后,其血清甘膽酸濃度都穩定在低水平。當肝細胞受到損傷時，肝細胞攝取甘膽酸的能力下降，導致血中的甘膽酸含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸就會發生障礙，從而返流血液循環的甘膽酸含量就會增高，使血中甘膽酸含量也增高。所以，測定血清甘膽酸是評價肝細胞功能和肝膽系物質循環功能的敏感指標之一[2]。

本試驗評估的甘膽酸試劑盒，采用均相酶免疫法測定樣本中甘膽酸(CG)的含量。本試驗從攜帶污染率、精密度、線性、最低檢測限、參考范圍驗證等方面測試甘膽酸試劑盒的性能指標，評估其臨床應用能力。

一、材料與方法

（一）對象

1.攜帶污染率：將已知甘膽酸高濃度值血清（約40μg/ml）、分裝5份于-20°C凍存，和去離子水5份，用于攜帶污染試驗[3]。

2.精密度驗證混合血清：將已經知道甘膽酸濃度的患者的血清進行混合，制備高濃度和低濃度（約40μg/ml和2.5μg/ml）的兩份混合血清，各分裝為20份，置于-20°C冷凍保存用作精密度試驗。

3.線性：將已經知道甘膽酸濃度的患者的血清進行混合，制備高濃度（約40μg/ml）的一份混合血清，和準備0水平校準品，用于線性試驗。

4.靈敏度的確定：采用0水平定標品連續進行10次測定, 采用多個水平校準物里的最低水平（1水平）的樣本連續進行3次測定，用作最低檢測限的試驗。

5.參考范圍驗證血清：參考文獻[4]所述，從2015年9月份某醫院健康體檢中心體檢人群中選擇出臨床診斷基本正常, 肝功能和腎功能以及脂類項目的結果，還有腫瘤標志物的結果都正常的被檢測者的血清，一共50例，用作參考范圍的驗證。

（二）儀器與試劑

1.儀器：OlympusAU5400全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特/美國） 。

2.主要試劑：浙江東甌診斷產品有限公司出品的甘膽酸測定試劑盒(均相酶免疫法)（批號2015060028）、配套校準品CG-S（批號150625 ）、配套質控品（批號150116，150117）。

（三）方法

1.攜帶污染率：用甘膽酸試劑測定高濃度值血清（約40μg/ml）、去離子水，連續測5天，每天測3次,利用下面的公式計算出每天的攜帶污染率, 并計算出5天的均值得到平均攜帶污染率，并確認試劑是否攜帶污染率達標[5]。樣品攜帶污染率= (空白1濃度-空白3濃度) /(高值1濃度-空白3濃度)×100%。

2.精密度評價：根據CLSI EP15-A文件[6]所提供的方案，用甘膽酸試劑測定出高、低2個水平（甘膽酸濃度約40μg/ml和2.5μg/ml）的混合血清，連續測5天，每天測4次。計算出每個水平的批內和總變異（CV%within、CV%tatal）,還要確認它的不精密度范圍是不是與廠商的名義標注的不精密度相符合。

3.線性范圍評價：甘膽酸試劑盒標定的線性范圍為0.8～50μg/ml，取甘膽酸高濃度血清樣本（38.21μg/ml）為H號樣本及0水平校準品（理論值為0μg/ml）為L號樣本，按1L、1/16H、1/8H、1/4H、1/2H、1H,配制成6個不同濃度梯度的混合血清。每份混合血清測定3次,記錄測定結果。按照CLSI EP6-A文件[3]提供的方案進行數據檢查，觀察有無離群值，判斷是否有重復性，然后進行多元線性回歸，將其結果擬合1次、2次、3次多項式，最后繪制出散點圖并進行評價。

4.靈敏度的確定: 用0水平定標品連續進行10次測定, 用多水平校準物中的最低水平(1水平) 樣本連續進行3次測定。通過下面的公式計算出測定下限( LOD) 和定量下限( LOQ) , 比較其與試劑說明書提供的檢測下限是否相同，如果高于試劑說明書所提供的檢測下限，就要根據臨床的需要判斷是否可以接受。

式[4]中: A代表0水平原始吸光度的標準差, B代表1水平的濃度,C代表0水平原始吸光度的均值, D代表1水平原始吸光度的均值。

5.參考范圍驗證：使用試劑測定50份參考范圍驗證血清中甘膽酸濃度，參考文件[4]進行評價。計算`x±3s, 判斷是否有檢測值落在`x±3s 以外的, 如果有的話, 將該值去除后再次進行計算, 然后判斷現有的參考范圍和計算所得的范圍是否相符。

（四）統計學分析

用Microsoft Excel 2003及SPSS 16.0軟件進行統計學的分析。線性回歸用簡單線性回歸進行分析，以P＜0.05表示回歸有統計學意義。

二、結果

1.攜帶污染率：甘膽酸試劑的平均攜帶污染率為0.47，符合臨床試劑盒的要求。

2.精密度評價：甘膽酸試劑的實際測定精密度小于試劑盒所標注的精密度，變異較小，可以滿足臨床的應用。

3.線性范圍評價：甘膽酸試劑的預期值與實際測定值散點圖如圖1所示。試劑評價的樣品濃度范圍為0～38.21μg/ml，數據組里沒有明顯的離群值，最佳擬合方程為一次多項式。試劑的預期值和實際測定值擬合的相關方程為y=bx+a，其中b=0.9674，a=0.4602，相關系數(r)大于0.975，故試劑的線性范為良好。

圖1.甘膽酸的線性圖

4.靈敏度：LOD=0.02μg/ml，LOQ=0.10μg/ml，試劑說明書提供的最低檢測下限為0.8μg/ml，故此靈敏度符合要求。

5.參考范圍驗證：入選的50位健康人中，男性25名，女性25名，年齡范圍在20～70歲之間。測定50份入選者血清中甘膽酸濃度, 計算`x為1.33，SD為0.44，發現有一個測定值（3.47）落在`x±3s 的外面,除去該測定值之后再次進行計算,判斷廠家提供的參考范圍和計算所得的范圍相符。

三、討論

甘膽酸（CG）是主要膽汁酸之一，它的代謝是肝臟的一個主要功能。血清甘膽酸是檢測肝細胞損傷的敏感性與特異性的指標。有研究顯示血清結合甘膽酸放射免疫分析對消化系統生理和病理的研究及臨床肝功和肝癌的診斷都有重要意義[7]。除此以外，甘膽酸對妊娠期肝內膽汁淤積癥及膽道系統疾病等多種疾病的診斷也都有重要的意義[8]。目前，臨床用于評價肝功能的指標有多種，但甘膽酸反映肝細胞的損害比目前臨床上常用的ALT（丙氨酸轉氨酶）、AST（谷草轉氨酶）等更敏感[7]，能早期發現輕度肝損害，對區別慢性肝炎病情嚴重程度有幫助。有研究顯示，急性肝炎患者血清甘膽酸水平與ALT呈正相關；而重癥肝炎時，由于酶膽分離，ALT正常，而甘膽酸仍然升高，在肝病轉為慢性時，甘膽酸仍保持高水平。因此，甘膽酸的檢測也可以作為肝臟疾病診斷和治療以及預后分析的重要依據。

血清甘膽酸也是妊娠晚期的血清里最主要的膽汁酸成分之一。孕婦正常妊娠時的血清甘膽酸水平會隨著孕周期逐漸升高的,直到足月時孕婦甘膽酸的水平都比不懷孕的時候增加30%～60% 。很多研究表明,孕婦中血清甘膽酸的水平由于妊娠期分泌大量雌激素、孕激素和胎盤合成以及代謝負荷的增大,可能會導致肝膽系統的變化[9],孕婦就比較容易患上妊娠肝內膽汁淤積癥 。該病患血清甘膽酸水平比正常孕婦高,達10～100倍，該病患增高的血清甘膽酸會增加羊水污染率、早產率、胎兒宮內窘迫率以及剖宮產率,當甘膽酸增高到10 倍以上的時候,以上危險會加大。同時,該病患會出現膽汁排泄障礙，膽汁淤積和膽栓，導致外周循環膽酸堆積，從而血清甘膽酸水平增高，皮膚會出現瘙癢的癥狀。由于孕婦的血液和羊水里膽汁酸都升高了,還會造成子宮內胎兒出現缺氧，引起早產或者胎兒宮內窘迫等。通過國內的有關報道，得知胎兒宮內窘迫癥發生率高達44%～60.6%，早產率也達13%～42.4%[10]。

目前，檢測血清甘膽酸含量主要有酶聯免疫法和RIA以及化學發光免疫分析法等方法[11]。還有一些不適合廣泛應用到臨床檢驗的，如氣液色譜、高效液相色譜，以及氣相色譜和質譜聯用等[12]。

本試驗所評估的甘膽酸試劑盒，采用均相酶免疫檢測法，能夠實現在全自動生化儀器上對甘膽酸的大批量檢測及快速化檢測，靈敏度高、特異性強。

本次試驗參考CLSI文件進行部分調整后對甘膽酸試劑的攜帶污染率、精密度、線性、最低檢測限、參考范圍驗證等方面進行了性能評價，結果顯示該試劑的性能參數能滿足臨床檢測需求，為臨床診斷提供可靠的依據。