矮牡丹與芍藥屬其他5個種葉綠體基因組特征的比較

周曉君 張 凱 彭正鋒 孫姍姍 押輝遠 張延召 程彥偉

(1.洛陽師范學院生命科學學院 洛陽 471934； 2.河南小秦嶺國家級自然保護區管理局 三門峽 472500；3.洛陽牡丹研究院 洛陽 471000)

牡丹是芍藥屬牡丹組(Paeoniasect.Moutan)植物的統稱(APG Ⅳ, 2016)。除了以“花中之王”的美譽供觀賞之外，牡丹還有很高的經濟價值：其根皮“丹皮”為復方中的常用藥材之一，列入中國藥典；牡丹籽油富含α-亞麻酸等不飽和脂肪酸，是很有發展前途的健康食用油之一(洪德元等, 2017)。由于牡丹具有較高的觀賞和經濟價值，在世界各地廣泛栽培。中國特有的野生牡丹一直被國內外視為珍貴的種質資源，開展野生牡丹系統進化的研究以及栽培牡丹起源的研究對闡明牡丹的起源、培育和改良栽培品種具有重要的理論和實踐價值(Zhaoetal., 2008)。葉綠體普遍存在于陸地植物、藻類和部分原生生物中，是進行光合作用的關鍵場所，是具有自主遺傳信息的重要細胞器(邢少辰等, 2008)。典型的被子植物葉綠體基因組為環狀四分體結構，即2個反向互補重復序列(inverted repeat，IRa和IRb)、大單拷貝區(large single-copy，LSC)和小單拷貝區(small single-copy，SSC)。與核基因組相比，葉綠體基因組較小，序列保守，結構穩定，遺傳重組率低，屬于母系遺傳，其結構和序列信息在揭示物種起源、進化演變及物種間親緣關系等方面具有重要價值(Mccauleyetal., 1996; 王玲等, 2012)。

近年來，先后有不同學者對芍藥屬植物葉綠體基因組進行了研究。Zhang等(2016)對芍藥屬芍藥組(PaeoniaSect.Paeonia)藥用植物川赤芍(P.veitchii)進行葉綠體基因組測序；Li 等(2018)對芍藥屬牡丹組中僅有的2種開黃花的野生牡丹大花黃牡丹(P.ludlowii)、滇牡丹(P.delavayi)的葉綠體進行了測序并分析其特征；Guo等(2018)對油用鳳丹牡丹(P.ostii)進行了綠葉體測序并將其與其他幾種芍藥屬植物的葉綠體特征進行了對比。作為7種野生牡丹之一，矮牡丹(P.jishanensis)被認為是現代栽培牡丹品種重要的祖先種(Yuanetal., 2014; Xuetal., 2016)。對矮牡丹葉綠體基因組特征進行分析，并將其與已發表的其他5種芍藥屬植物葉綠體基因組進行對比，旨在為牡丹種質資源的開發和利用提供科學依據，也可為今后芍藥屬植物系統進化關系研究及種質資源的鑒定提供基礎性數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于葉綠體基因組測序的矮牡丹組織樣本采集于山西省稷山縣馬家溝(35°43′N, 110°58′E)。利用天根試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA備用。

1.2 總DNA測序

將檢測合格的DNA樣本用超聲波進行片段化，經純化后進行末端修復、3′端加A及連接測序接頭，用瓊脂糖電泳選擇合適片段大小。通過PCR擴增后構建測序文庫，質檢合格的文庫利用Illumina HiSeq 2500平臺進行測序。

1.3 組裝與注釋

測序獲得的原始數據利用CLC Genomics Workbench 9.0軟件(CLC Bio，Aarhus，Denmark)過濾去除低質量序列(參數設置為：Ambiguous limit=2，Quality limit=0.05)(Wambuguetal., 2015)。以大花黃牡丹葉綠體基因組(KY817592)作為參照(Lietal., 2018)，將過濾后的11 322 016條reads采用Hahn等(2013)的組裝方法構建葉綠體基因組。最終得到長度為152 628 bp的矮牡丹葉綠體全基因組序列。共有145 741條葉綠體reads參與組裝，平均覆蓋率為141.9×。利用Geneious 8.0軟件進行矮牡丹與大花黃牡丹序列的CLUSTAL比對，進行堿基修正、修改蛋白質和tRNA等注釋，完成葉綠體基因組的分區。采用OGDraw在線工具(http:∥ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/)進行基因組圖譜繪制。

1.4 葉綠體基因組特征分析

圖1 矮牡丹葉綠體基因組物理圖譜

利用MISA(MicroSatellite identification tool)軟件(http:∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索矮牡丹葉綠體基因組中SSR位點并分析其特征。具體參數為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸為基序(Motif)的重復數分別設置為8、5、4、3、3、3，2個復合SSR位點間隔堿基數最大為100。用EMBOSS 6.4.0軟件(http:∥emboss.open-bio.org/)分析蛋白編碼基因密碼子偏好性(Riceetal., 2000)。從GenBank下載鳳丹牡丹、大花黃牡丹、滇牡丹、川赤芍和草芍藥5個種的葉綠體基因組全序列，與本項目矮牡丹葉綠體基因組序列進行多重比對。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征

與已發表的其他芍藥屬葉綠體基因組類似，矮牡丹葉綠體基因組為包含LSC、SSC、IRa和IRb 4個區段的共價閉合雙鏈環狀分子(圖1)，序列全長152 628 bp，GC含量為38.4%。其中LSC區段長84 292 bp，SSC區段長17 044 bp，IR區段為25 646 bp(Zhouetal., 2019)。基因組的GC含量是判斷物種間親緣關系的重要指標，矮牡丹LSC、SSC、IR區段GC含量與其他芍藥屬一致，分別為36.7%、32.7%、43.1%(Guoetal., 2018; Lietal., 2018)。在基因組大小方面，矮牡丹葉綠體基因組比鳳丹牡丹大475 bp，比川赤芍、大花黃牡丹、滇牡丹和草芍藥分別小54、59、70、70 bp(表1)。

葉綠體注釋結果表明，矮牡丹葉綠體基因組共有112個基因，包括蛋白編碼基因78個、tRNA基因30個和rRNA基因4個(表2)。其中，有19個基因(包括4個rRNA、7個tRNA、8個蛋白編碼基因)在IR區重復。LSC區段含有22個tRNA基因和60個蛋白編碼基因，SSC區段含有1個tRNA基因和10個蛋白編碼基因。研究表明，內含子在基因的表達調控中起著重要作用，許多內含子能夠增強外源基因在植物特定時間及特定部位的高水平表達，從而產生相關的農藝性狀(Jiaoetal., 2012)。矮牡丹蛋白編碼基因中，9個基因(atpF,ndhA,ndhB,petB,petD,rpl16,rpl2,rpoC1,rps16)含有1個內含子，3個基因(clpP,rps12,ycf3)含有2個內含子。

表1 芍藥屬6個種葉綠體基因組基本特征比較①

①LSC: Large single-copy region; SSC: Small single-copy region; IR: Inverse repeats.

表2 矮牡丹葉綠體基因組基因信息①

①*: 具有內含子的基因；a: 重復基因(存在于IR區域的基因)。*: Genes containing introns; a: Duplicated gene(genes present in the IR regions).

2.2 矮牡丹葉綠體基因組密碼子使用情況

在矮牡丹葉綠體基因組中，共有25 988個密碼子，編碼蛋白78個，其中編碼亮氨酸的密碼子數量最多，為2 716個，異亮氨酸、色氨酸的密碼子數量分列第2(2 223個)和第3(1 984個)。TAA為常用的終止密碼子(43個)，略高于TAG(21個)和TGA(21個)。矮牡丹葉綠體基因組中蛋白編碼基因密碼子偏好使用A/T堿基。在所有密碼子中，第1個、第2個和第3個堿基為A/T的分別占總密碼子數的54.04%、61.59%和68.89%。

2.3 葉綠體基因組SSR分析

在矮牡丹葉綠體基因組中搜索到143個SSR位點。其中，141個為普通型SSRs，2個為復合型SSRs；單核苷酸重復Motif位點最多為116個，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重復基序分別有13、6、5、1個，沒有發現六核苷酸重復基序(表3)。143個SSRs位點中，A/T組成的位點有134個，僅有9個位點含有G/C，這表明SSRs的堿基組成偏好；從分布區段上看，14個位點位于IR區段，103個位于LSC區段，26個位于SSC區段，說明矮牡丹葉綠體基因組SSRs分布的不均勻性。

2.4 芍藥屬6個種的葉綠體基因組IR邊界分析

植物葉綠體基因組IR的擴張與收縮是較為普遍的現象，它決定了不同植物葉綠體基因組大小(Huangetal., 2014)。為了探索IR潛在的擴張與收縮，比較了芍藥屬6個種的葉綠體基因組IR與SC邊界區域基因的分布狀況(圖2)。如圖所示，LSC/IR和SSC/IR邊界分布的基因包括rps19，rpl2，ycf1，ndhF和trnH。芍藥屬6個種的葉綠體基因組SSC/IRa邊界均為ycf1基因，且在不同的區域內ycf1基因分布長度不同，在草芍藥、鳳丹牡丹、大花黃牡丹、滇牡丹、川赤芍、矮牡丹的SSC區域內長度分別為4 325、4 352、4 340、4 355、4 327和4 346 bp，在IRa區域內的長度分別為1 087、1 078、1 078、1 078、1 076和1 078 bp。同樣地，trnH基因在6個種中均位于LSC區域內，分別距IRa/LSC邊界1、79、0、1 534、3、3 bp。rpl2基因僅在鳳丹牡丹中位于LSC/IRb邊界，與其他5個種不同。ndhF基因位于5個種的IRb/SSC邊界，而在川赤芍中位于SSC區域距邊界20 bp。

表3 矮牡丹葉綠體基因組SSRs類型信息

圖2 芍藥屬6個種的葉綠體基因組反向重復區(IR)、大單拷貝區(LSC)和小單拷貝區(SSC)邊界比對

3 討論

葉綠體基因組序列包含著解決復雜系統發育關系的諸多信息，被廣泛用于植物系統發育及農作物栽培種進化關系重建等領域(Cuénoudetal., 2002; 謝海坤等, 2017)。近年來，隨著高通量測序技術的飛速發展，基因組測序成本大大降低，葉綠體基因組獲得更加便捷。大多數被子植物葉綠體基因組都屬于典型的質體基因組4部分結構，即1對IR區將整個基因組劃分成2個單拷貝區域；都具有74個蛋白編碼基因，少數植物會在此基礎上增加5個蛋白編碼基因(Millenetal., 2001)。矮牡丹cp DNA基因組具有蛋白編碼基因78個、tRNA基因30個和rRNA基因4個。通過比較分析矮牡丹與芍藥屬其他5個種的葉綠體基因組序列可發現，從基因組大小和基因內容來看，芍藥屬葉綠體基因組高度保守。

密碼子是遺傳信息正確表達的關鍵。一般情況下，葉綠體基因組DNA上的起始密碼子序列分別為ATG、ATT、ATA。本研究中矮牡丹葉綠體基因組起始密碼子中除了ATG是最常見起始密碼子外，還有ATA、GTG、ATT 3種類型，這在其他被子植物中也有報道(Bortirietal., 2008)。不同葉綠體基因組的堿基組成有一定的差異，矮牡丹葉綠體基因組偏向于使用含有A/T的密碼子。密碼子偏好性與生物長期的進化歷史密切相關，因此研究矮牡丹密碼子的使用情況對芍藥屬物種進化模式的探究具有重要作用。SSR是一種重要的分子標記，常用于物種的居群遺傳學分析(Doorduinetal., 2011)。對矮牡丹葉綠體基因組中SSR的統計結果顯示，其SSR中含有豐富的A/T，而且多聚的A/T類型遠大于多聚的G/C類型，與地黃屬(Rehmannia)植物類似(Zengetal., 2017)。矮牡丹葉綠體基因組SSR位點的發現對芍藥屬植物鑒定、群體水平的多態性檢測及系統發育分析具有一定的意義。

不同物種間葉綠體基因組IR/SC邊界位置的變化是較為普遍的現象，這些變化通常在同一科的物種中也會有所不同。研究表明，芍藥屬6個種的葉綠體基因組盡管在結構和大小方面比較保守，但不同物種間IR和SC的邊界位置仍有一定變化。與其他5個種相比，鳳丹牡丹的IR(24 863 bp)是6個種中最小的，存在收縮現象，這主要表現在LSC/IR的rpl2基因上。該基因在鳳丹牡丹中有718 bp延伸至LSC區域，而其他種的rpl2基因均完整地位于IR區。所以芍藥屬LSC/IRb的邊界變化是IR區擴張與收縮的主要原因，這與地黃屬葉綠體基因組的研究結果一致(Zengetal., 2017)。

芍藥科(Paeoniaceae)在被子植物中十分孤立，其系統位置一直存在激烈爭論。基于分子系統學的被子植物系統發生顯示：芍藥科與虎耳草科(Saxifragaceae)、景天科(Crassulaceae)和金縷梅科(Hamamelidaceae)等構成一大支，即虎耳草目(Saxifragales)(APG Ⅳ, 2016)。但芍藥科在虎耳草目中究竟與哪類植物最近，仍然是一個懸而未決的問題(洪德元等, 2017; Jianetal., 2008)。本研究可為今后芍藥科植物系統進化關系研究提供基礎性數據。

4 結論

芍藥屬6個種的葉綠體基因組為典型的包含4個區段的共價閉合雙鏈環狀分子，GC含量均為38.4%，且在LSC、SSC、IR區段GC含量一致，所有芍藥屬植物葉綠體基因組從長度到GC含量均高度保守。矮牡丹葉綠體基因組中，共有25 988個密碼子，編碼亮氨酸的密碼子數量最多，為2 716個，矮牡丹葉綠體基因組偏向于使用含有A/T的密碼子。矮牡丹葉綠體基因組中共有143個SSR位點，單核苷酸重復Motif位點最多為116個，SSR中多聚的A/T類型遠大于多聚的G/C類型。明確了6種芍藥屬植物在每個區段的不同，指出LSC/IRb的邊界變化是IR區擴張與收縮的主要原因。