‘冷白玉’棗果實發育過程中內源激素變化與胚敗育的關系*

任海燕 王永康 趙愛玲 薛曉芳 弓桂花 杜學梅 李登科 杜俊杰

(1.山西省農業科學院果樹研究所 果樹種質創制與利用山西省重點實驗室 太谷 030815; 2.山西農業大學園藝學院 太谷 030801)

棗(Ziziphusjujuba)胚早期敗育現象非常嚴重，阻滯了棗雜交育種。祁業鳳等(2004)統計了《中國果樹志·棗卷》中471個棗種仁發育情況，敗育率高于50%的品種占58%。劉孟軍等(2009)于2003—2005年連續3年調查國家棗資源圃300個棗品種的胚敗育狀況，發現花后1個月胚敗育率高于90%的品種占33.8%。生產中棗農為獲得較高的坐果率，長期運用花期開甲技術，并在花期多次噴施GA，取得了較高的經濟效益(何業華等，1993；劉孟軍等，2015)。但是，隨著年份、氣候條件的改變(金竹萍，2003)，加之生產中GA的大劑量使用，出現了高比例的胚敗育現象(梁春莉等，2010)。這種高比例的棗胚敗育現象，嚴重制約了棗常規雜交育種的進程，棗果實發生胚敗育的原因有待深入研究。

植物激素與胚敗育有密切的關系，目前果樹中已有葡萄(Vitisvinifera)(Wangetal., 2012；Reynoldsetal.，2016；Ebadietal.，2016)、荔枝(Litchichinensis)(陳偉等，2000)、芒果(Mangifera)(賀軍虎等，2012；Shabanetal., 2009)等樹種開展了相關研究。關于棗胚發育與激素的關系也有一些報道：胡芳名等(1998)在長棗(Z.jujuba‘Changzao’)上研究認為，幼果果肉中低含量的ABA和IAA可導致棗胚早期敗育；祁業鳳等(2004)比較了低度敗育型冬棗(Z.jujuba‘Dongzao’)和高度敗育型梨棗(Z.jujuba‘Lizao’)果實發育過程中激素水平變化情況，幼胚的正常發育需要高水平的ZT和IAA，且果肉中高含量的生長類物質不利于胚發育；王玖瑞等(2008)研究了棗雄性不育種質果實發育期間內源激素含量變化，認為生長抑制類激素和生長類激素的比值與胚胎發育有關。但上述研究主要采用了不同敗育類型的棗品種作為試材。因高敗育棗品種的敗育胚難以取材，無法將敗育胚與正常胚進行對比研究，這就給棗胚敗育機理的研究帶來了極大的困難。

選用具有正常胚和敗育胚的同一棗品種為試材，可避免棗品種間胚發育時期不一致、敗育胚取材難的問題。目前針對基因型一致的棗品種果實發育過程中內源激素含量變化的研究還未見報道。本試驗以中等敗育品種‘冷白玉’棗為試驗材料, 從研究果實前期的發育及內源激素變化規律入手，初步探索棗胚敗育機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中等敗育品種‘冷白玉’棗采自山西省農業科學院果樹研究所國家棗資源圃，該品種盛花期為6月上旬，以黃蕾期(蜜盤剛出蜜)為自然授粉時期，定花定果，采集不同胚齡的幼果。

在前期研究的基礎上，確認‘冷白玉’棗20、30、40、50天左右胚齡的幼胚依次正值原胚、小球形胚、球形胚、魚雷形胚，且40天正值敗育高峰期(李登科等, 2016; Renetal., 2019)。采集20、30、40、50天的幼果，每個時期采集50個，觀測果發育狀況，重復3次。每個時期采集幼果200個，重復3次，于冰塊上剝開棗果，觀察胚胎是否敗育，并分為正常胚、敗育胚、胚正常果實的果肉、胚敗育果實的果肉共4組；收集材料要快速完成，用錫紙包裹，液氮速凍后-80 ℃保存，用于生長素(IAA)、赤霉素(GA4)、順式脫落酸(cABA)和反式脫落酸(tABA)含量的測定。

判斷胚是否敗育的方法為：剖開果實觀察，胚珠瘦小、部分組織褐化、變黑、軟化、明顯萎縮皺縮、干癟壞死或胚完全消失為胚敗育果實，反之則為胚正常果實。

1.2 試驗方法

用電子天平稱量果實質量，游標卡尺測量縱、橫徑，取平均值。剝開胚，觀察胚珠發育狀況。

稱取果肉5.0 g、胚1.0 g進行激素含量的測定。每個時期重復3次。果實內源激素含量用氘代同位素內標定量計算法，激素組分用液相色譜-質譜(HPLC-ESI-MSn)定量分析檢測(Liuetal., 2013)，測試在北京林業大學生物工程重點實驗室完成。

1.3 統計分析

各項指標均重復3次以上，取平均值。試驗數據采用Excel 2003處理，采用SAS8.0進行Duncan’s多重比較(P<0.05)統計分析。

2 結果與分析

2.1 棗幼果及幼胚發育狀況觀察

‘冷白玉’棗花后10～50天，果實體積逐漸增大。在20～50天，隨著果實逐漸增大，胚珠外表皮由綠白色變為淡黃色，種核逐漸木質化，胚乳由透明狀變為乳白色固體狀，胚起初由不可見逐漸微見綠色。在花后20天，胚珠外表皮白色微綠，胚乳透明晶亮(圖1A)；30天胚珠外表皮發育為白色(圖1B)；40天后胚珠外表皮呈黃白色，有韌性，胚乳呈乳白色(圖1C)；50天胚珠外表皮呈黃白色，核硬化，棗果皮顏色由深綠色逐漸變淺。解剖發現，正常胚體飽滿而大，而敗育胚不飽滿，且胚珠表面局部或全部褐化(圖1D)。花后40天，棗胚褐變發生敗育，胚體變黑且失去活性。

圖1 ‘冷白玉’棗果及胚胎發育情況

2.2 棗果實生長發育動態

由圖2可知，棗果在花后20天，開始快速生長，起初單果質量增加較慢，花后30天快速增加；縱徑生長比橫徑生長開始早，速度快，花后30天以后，縱徑生長速度逐漸減慢，而橫徑生長速度增加。50天時縱、橫徑分別達到成熟果的60%～70%，質量為成熟果的58.83%。

圖2 ‘冷白玉’棗果實的發育

圖3 ‘冷白玉’棗果中GA4、IAA、cABA及tABA含量的變化

2.3 不同發育時期‘冷白玉’棗幼果中內源激素含量的動態變化

2.3.1 GA4含量的變化 由圖3A可知，胚中GA4的含量明顯低于果肉，并一直處于較低的水平。正常胚中GA4含量低于敗育胚。花后30天，敗育胚GA4含量開始升高；花后50天，敗育胚含量達到最大，為0.302 ng·mg-1，且明顯高于正常胚中GA4含量 0.011 ng·mg-1。

在果肉中，胚發育正常的果肉和敗育果肉中的GA4含量變化規律基本相似，表現為先升高后降低的趨勢(圖3A)。然而，胚正常果肉中，GA4含量在花后40天達到最大值，為2.560 ng·mg-1；敗育胚果肉中，GA4含量則在花后30天達到最大，隨后降低，且低于幼胚果肉。

2.3.2 IAA含量的變化 胚中IAA的含量明顯高于果肉。正常胚中IAA含量呈逐漸升高趨勢，花后50天時達到最大，為15.895 ng·mg-1。而敗育胚中的IAA含量則呈逐漸下降趨勢(圖3B)。

在果肉中，胚敗育的果肉中IAA含量花后30天下降，之后逐漸上升并超過胚正常的果肉，而胚正常的果肉中IAA含量變化呈先上升后下降趨勢，并在花后30天達到最大值，其后逐漸下降，40天后低于胚敗育果肉中含量。胚正常果肉中IAA含量呈倒V字形，而胚敗育果肉中呈正V字形(圖3B)。

胚敗育果的胚和果肉中IAA含量均呈逐漸下降趨勢，而正常胚中其含量仍保持較高水平，且遠遠高于果肉(圖3B)。這與祁業鳳(2004)對梨棗的研究結果一致，梨棗果肉中IAA含量20天后呈逐漸下降趨勢，說明幼胚中高水平的IAA有利于胚的正常發育。

2.3.3 ABA含量的變化 cABA在果肉和胚發育過程中變化較為一致，均表現為逐漸降低趨勢。在胚正常棗果中，胚中cABA含量大于果肉中的含量；在胚敗育棗果中，則表現為果肉中cABA含量大于胚中的含量(圖3C)。

圖4 ‘冷白玉’棗果中內源激素的平衡關系

胚中tABA的含量高于果肉。正常胚中tABA的含量在胚發育初期呈下降趨勢，并在50天時達最低值；而在敗育胚中tABA呈逐漸上升趨勢，并在后期高于正常胚(圖3D)。

胚正常發育的果實果肉中和胚中的tABA含量變化表現一致，呈先下降之后緩慢升高的趨勢。而在敗育胚的果肉中呈先下降30天后又上升，在40天出現一個小峰值，之后又下降，并高于胚正常的含量(圖3D)。

2.3.4 內源激素平衡關系對果實發育的影響 從圖4A得知，在胚中，花后20～50天，正常胚中(GA4+IAA)/ABA比值逐漸上升，而敗育胚中迅速下降，二者差異顯著。在果肉中，花后20～40天，胚正常果中(GA4+IAA)/ABA的比值呈逐漸上升趨勢，在花后40天，達到峰值，之后逐漸下降；胚敗育果中(GA4+IAA)/ABA的比值在30天達到最大，之后迅速下降，在40天后下降趨勢逐漸緩慢。在30～40天，正常胚的果實中果肉的(GA4+IAA)/ABA比值逐漸上升，而胚敗育的果肉中其比值迅速下降，而此時正值果實迅速膨大期，胚正常果肉中生長類的激素含量超過抑制類的激素并迅速上升，果實生長加快，而胚敗育的果肉中抑制類激素超過了生長類激素，果實生長緩慢。

由圖4B中GA4/ABA值看出，果肉中GA4/ABA大于胚中。在果肉中，胚正常果肉中GA4/ABA呈逐漸增高趨勢；胚敗育果肉中GA4/ABA在30天時達到峰值，之后降低。而在胚中GA4/ABA較低，正常胚中其變化呈逐漸降低，敗育胚中其變化呈上升趨勢。可見在胚中，較低的GA4/ABA利于胚的正常發育，而果肉中較高的GA4/ABA利于棗果的正常生長。

由圖4C可知，胚中 IAA/ABA高于果肉。正常胚中，IAA/ABA不斷增加，敗育胚中，則呈下降趨勢。胚敗育果肉中，IAA/ABA呈先降低后升高趨勢，在胚正常果肉中，在30天出現一個小高峰后逐漸降低，花后40天后，其比值保持平穩。可見，果肉中較高的生長促進類激素，增加了果肉爭奪養分能力，使得胚獲得養分減少，可能是導致棗胚敗育的重要原因。

從圖4D中IAA/GA4值的變化看出，胚中IAA/GA4遠遠大于果肉。在果實發育過程中，果肉中，其比值呈先降低后升高趨勢，而在胚中表現為先升高后降低趨勢，且胚正常型果肉大于胚敗育型果肉，因此初步認為，胚中高比值的IAA/GA4利于幼胚的正常發育。

3 討論

3.1 IAA含量變化與胚發育的關系

生長素在生物合成、極性運輸和信號轉導等多個層次控制著胚胎的發育過程(宋麗珍等，2013；翟開恩等，2015)。IAA是胚胎發育期間主要作用的生長素類物質，在胚胎發育過程中IAA含量的變化被認為是胚胎發生的早期信號，高水平的IAA可以維持較強的胚胎細胞活性，并通過細胞伸長來實現胚的膨大伸長，促進胚發育(Kongetal., 1997；梁艷等，2016)。本研究發現，正常胚IAA含量在20～30天即原胚和小球形胚發育時期緩慢增加，在40天(球形胚)后迅速增加，這可能與分生組織開始發育前多的IAA來維持更強的胚細胞活性有關；而敗育胚中IAA含量變化整體呈下降趨勢，起初緩慢下降，在敗育高峰期花后40天球形期后急劇下降。Cheng等(2007)認為，在IAA調控信號途徑中，低濃度IAA使yuc1yuc4yuc10yuc11四突變體在擬南芥(Arabidopsisthaliana)球形期胚發生階段受到抑制，從而誘發胚發育缺陷。可見，IAA在棗胚發育過程中起重要作用。本研究結果中正常胚IAA含量逐漸增高趨勢與在冬棗中的研究結果(祁業鳳等，2004)一致，但不同于冬棗胚胎坐果后40天時IAA含量達到高峰之后維持較高水平的結果，這可能與不同品種間胚胎發育時期不同有關。

果實中的植物激素來源于種子，種子與果肉中的植物激素相互影響(Kondoetal.，2001)。在本研究中，果肉中IAA含量一直處于較低水平，遠遠低于胚中的含量，這與陳偉等(2000)、祁業鳳等(2004)的研究結果相似，而不同于杜維等(2018)沙棘(Hippophaerhamnoides)果中IAA一直保持較高水平的研究結果。本研究中IAA在棗胚正常果肉中呈先上升后下降，這種變化趨勢與葡萄果肉(Gouthuetal., 2015；高江曼等，2017)中及栗(Castaneamollissima)葉片中(Wangetal.，2012)IAA變化趨勢相似。而在棗敗育胚果肉中IAA含量變化呈正V形，相應的敗育胚中則呈逐漸下降趨勢。這很好地說明敗育胚果肉中生長類激素的增加，使得果肉爭奪能力增強，導致種子獲得養分減少，發生敗育。

3.2 GA4含量變化與胚發育的關系

GA被廣泛用于葡萄、草莓(Fragaria×ananassa)、番茄(Lycopersiconesculentum)等果實的單性結實。目前發現赤霉素136種，其中GA3在促進細胞增長、形成無核果實等方面有重要的作用(Mesejoetal., 2016)。GA4較GA3的生物活性低，但對于胚軸生長和提高坐果率方面起著重要作用(Curry，2012；杜維等，2018)。對番茄的研究表明，GA4含量的增加受CcGa20oxl基因的調控，可導致單性結實(張映等，2018；Garcia-Hurtadoetal., 2012)。在褪黑素誘導‘紅茄’梨(Pyruscommunis‘Starkrimson’)單性結實的研究中發現，外施褪黑素上調了子房內PbGA20ox并下調PbGA2ox基因的表達，使GA3和GA4含量增加，從而誘發單性結實的形成(Liuetal., 2018)。關于GA4影響棗胚發育的研究較少。從本研究‘冷白玉’棗果實發育過程中GA4的含量變化來看，果肉中GA4的含量明顯高于胚，胚中GA4含量則一直保持較低水平。祁業鳳等(2004)研究也得出棗果肉中GA3含量高于胚中含量的結果，但在變化趨勢上有所不同，果肉含量變化表現為逐漸降低的趨勢，不同于本研究中GA4含量呈先升高后降低的趨勢。果肉中高含量的GA可能是多數棗敗育型品種能繼續膨大生長的一個原因，同樣的結果也出現在Adam等(1999)的研究中。王玖瑞等(2008)研究表明，棗雄性不育種質胚中GA3含量高于果肉的含量，可能與不同品種間激素水平的差異有關。關于棗果的GA4、GA3含量變化在促進胚發育方面哪個發揮著更重要作用，其作用及其機理還需要進一步研究。

3.3 ABA含量變化與胚發育的關系

ABA在促進種子成熟期的貯藏蛋白合成方面起著重要的作用，此外還作為胚性狀態保持劑有維持胚的正常生長發育等方面的作用(Quatrano, 1987)。研究表明，ABA 在紅松(Pinuskoraiensis)胚胎發育過程中尤其是中后期的胚胎形態建成及早期階段起著關鍵性的作用(梁艷等，2016)。在發育中后期胚中ABA的急劇上升是導致胚胎敗育的一個重要因素(祁業鳳等，2004；王玖瑞等，2008)。本研究中花后20～50天棗果發育階段，胚正常果肉和胚敗育果肉中的總ABA含量均呈下降趨勢，其中胚敗育果肉中總ABA含量高于胚正常果肉，而在胚中，正常胚總ABA含量逐漸下降，敗育胚含量則逐漸增加。這也證實了在胚發育中后期總ABA含量的增加與胚敗育有密切的關系。

天然存在的ABA是一個15碳的倍半萜羧酸，順式脫落酸cABA和反式脫落酸tABA互為脫落酸的順反異構體，其生理活性取決于C-2處的雙鍵是順式，即cABA是具有生理活性的，而tABA則相對比較穩定，在光中異構化后才有活性(Bhatlaetal., 2018)。依據ABA的作用方式劃分為涉及核酸蛋白合成的“慢反應”和主要作用在質膜上的“快反應”。幼嫩的器官中所含的ABA能促進依賴于K+的H+/糖的卸載，而在成熟器官中ABA的主要功能可能是與啟動特殊酶和蛋白質的合成及膜的泄漏有關(Qinetal., 1985)。在發育早期稻(Oryzasativa)胚中研究推測，cABA可能參與了“慢反應”，是總ABA庫的鈍化形態(覃章錚等，1990)。本研究中，果肉和胚中所含cABA含量隨胚的發育逐漸降低，而tABA含量在中后期有所升高，由此推測在棗胚發育的中后期，具有活性的cABA可能部分轉化為較為穩定的tABA，使得tABA在ABA影響胚發育的過程中起主導作用。胚敗育和胚正常果肉中cABA含量變化趨勢一致，均呈下降趨勢，而胚中tABA含量高于果肉，在敗育胚中，tABA呈持續上升的趨勢，在40天后含量高于正常胚，且胚敗育果肉中其含量也高于胚正常果肉。由此推測tABA可能與幼胚早期敗育有關。

3.4 激素間動態平衡對幼胚發育的影響

胚胎發育不僅與單一內源激素含量有關，還與各類激素之間的平衡，尤其是促進生長類激素與抑制生長類激素之間的比例及平衡有關(許智宏等，2012)。ABA與GA之間存在拮抗作用，它們的相對含量及敏感性在胚發育過程中起重要作用(楊榮超等，2012；伍靜輝等，2018)。IAA與GA之間相互協同，GA的合成需要IAA存在，IAA應答因子作為GA信號途徑的激活劑，調控其表達(Mcateeetal., 2013)。本研究中，棗胚中(IAA+GA4)/ABA比值隨胚的發育呈現逐漸增加的趨勢，尤其在花后40～50天，即球形胚末期到魚雷形胚快速增加，此時果實快速膨大，說明這個時期需要更高的生長促進激素；反之，(IAA+GA4)/ABA降低，不能滿足幼胚生長所需，導致了敗育的發生。此外，從(GA4+IAA)/ABA、IAA/ABA、GA4/ABA比值的變化趨勢看，趨勢較為一致，正常胚及其果肉均呈上升趨勢，而敗育胚及胚敗育果肉中均呈下降趨勢。這就意味著GA4、IAA、ABA影響胚胎發育可能是通過生長抑制激素與生長促進激素的平衡，這與在其他果樹上研究的結果(陳偉等，2000；張新友等，2013)一致。

另外，胚的發育是由合子經過一系列細胞分裂而形成一個完整成熟胚的過程。作為刺激細胞分裂和生長作用的細胞分裂素，在胚的發育過程中起著重要的作用。陶建敏等(2006)認為，生長素和細胞分裂素的平衡影響胚的發育。并且較高的ZT、GA和IAA含量能促進子房的正常發育(Zangetal., 2011)。但也有研究認為，植物體內的GA、IAA、ABA激素變化是由乙烯信號誘導而成的，乙烯是胚敗育的誘導因素(張鳳路等，1999)。關于植物激素之間的關系、胚與果肉中各激素如何相互影響的機制較為復雜，仍待進一步探討。

4 結論

‘冷白玉’棗胚中IAA的含量顯著高于果肉，果肉中GA4的含量高于胚。胚中低水平的GA4、較高水平的IAA及后期低含量的tABA和cABA、高IAA/GA4比值有利于幼胚的正常發育。胚發育過程中IAA下降、tABA增加及(GA4+IAA)/ABA比值下降是導致胚敗育的重要因素。棗幼胚發育前期，需要較高的生長類激素促進生長，而在發育后期則需要一定量的ABA，其中tABA與胚胎早期敗育有關。