基于譜-效關系探究黃芩抑制白色念珠菌的質量標志物

商利娜 王亞靜 ?趙 鑫趙海寧周夢楠張 怡高 迪王雁雯葉相印

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津301617； 2.天津中醫藥大學，現代中藥發現與制劑技術教育部工程研究中心，天津301617）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其性寒，味苦，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經［1］，最早記載于《神農本草經》，具有清熱祛濕、瀉火解毒等功效；現代藥理學表明，黃芩提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗炎、抗氧化等作用［2-3］，對多種致病菌的抑制作用是其重要藥效物質基礎之一。黃芩苷是黃芩中含有量最高的成分，也是2015 年版《中國藥典》 規定的質量控制成分。

目前，黃芩提取工藝及質量控制大多是根據《中國藥典》 或文獻，以黃芩苷或總黃酮為指標［4-6］，但也有對黃芩譜-效關系進行研究的報道，發現其抑制金黃色葡萄球菌關聯性最強的成分是白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，而不是黃芩苷［7］。因此，應制定適宜的方法進行相關分析，以提高黃芩質量控制的科學性。

另有研究表明，黃芩對白色念珠菌具有一定抑制作用。白色念珠菌是一種常見的條件性真菌病原體，當機體抵抗力低下或菌群失調時它會大量繁殖并形成芽生菌絲，侵犯皮膚、黏膜或內臟，引起鵝口瘡、外科傷口感染、真菌血癥等疾病［8-9］，但目前黃芩抑制白色念珠菌的質量標志物仍不清晰，因此有必要對相關質量標志物進行考察。

中藥質量標志物是在中藥材和中成藥中固有的或加工過程中形成的、與中藥功能屬性密切相關的化學物質，是反映中藥質量和藥效的存在［10］；中藥指紋圖譜是反映中藥所含所有化學成分種類和數量的一種形式，在一定程度上可揭示其化學特征，目前已成為中藥質量評價的有效方法，但它僅能反映化學信息，并不能體現與藥效學相關的具體成分［11］，故若要科學評價中藥質量，就應開展指紋圖譜與藥效的相關性研究，即譜-效關系。

灰色關聯分析是一種用于中藥質量評估的相關性分析方法，可定量描述事物或因素之間關聯性的大小，也能反映各指標性成分對藥效的貢獻程度［12-13］。因此，本實驗采用該方法對黃芩進行譜-效關系研究，根據各成分貢獻程度來確定該藥材抑制白色念珠菌的質量標志物。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置Agilent 20RBAX Eclipse Plus 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；LS-B50 L 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海醫用核子儀器廠）；SW-CJ-JF 垂直層流超凈工作臺 （蘇州凈化廠）；HPX-9052MBE 電熱恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；Infinite 200 PRO 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；FA124 電子天平（天津億諾科學儀器有限公司）；YP1001電子天平（上海箐海儀器有限公司）；AX205 電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；默克純水機（天津信睿生物科技有限公司）；N-1210B 旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩飲片 （批號190102，產地山西） 購自河北安國市譽林藥業有限公司，經專家鑒定為正品。黃芩苷 （批號P20A9F59353）、黃芩素 （批號C20MBY31962）、漢黃芩 素 （批 號W30M10284622）、橙皮苷（P06D9F77001） 對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；漢黃芩苷對照品（批號823B022） 購于北京索萊寶科技有限公司。乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水。

1.3 菌種與培養基 白色念珠菌 ［編號BNCC337321（＝ATCC1231）］ 購自北納創聯生物技術有限公司。改良馬丁瓊脂培養基購自北京索萊寶生物科技有限公司；改良馬丁培養基購自山東拓普生物工程有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱取4 份藥材粗粉，每份10 g，加入水或60%乙醇200 mL，以回流水提取、回流60%乙醇提取、溫浸水提取、溫浸60% 乙醇提取4 種方式各提取2 h，提取液放涼后，對應溶劑補足減失的質量，離心棄去藥渣，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，4 ℃下備用。

2.1.2 內標溶液 精密稱取橙皮苷對照品1.47 mg，甲醇定容至25 mL，即得（質量濃度為58.8 μg／mL），4 ℃下備用。

2.1.3 對照品溶液 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，甲醇溶解，制成質量濃度分別為0.516、1.000、0.506、0.515 g／L 的貯備液，各吸取1 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲混勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 抑菌用供試品溶液 取“2.1.1” 項下藥液適量，旋蒸至生藥量1 g／mL，即得。

2.1.5 試驗用菌液 將白色念珠菌凍干粉進行復蘇、活化、傳代至第3 代，取10 μL 加到10 mL 改良馬丁液體培養基中，于30 ℃恒溫培養箱中靜置培養24 h，即得（菌濃度為1×107CFU／mL）。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，85%～75% B；25～40 min，75%～70% B；40～45 min，70%～60% B；45～60 min，60%～57% B；60～65 min，57%～30% B；65～70 min，30%～85%B；70～75 min，85% B）；體積流量1 mL／min；檢測波長202 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2.2 圖譜分析 對照品溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾后，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1A；取“2.1.1” 項下供試品溶液1 mL 于5 mL 量瓶中，對應溶劑定容至5 mL，取1 mL，與1 mL “2.1.2” 項下內標溶液混合，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1B。

圖1 對照品HPLC 色譜圖及供試品HPLC 指紋圖譜

2.3 體外抑菌實驗 根據美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 操作規范，采用微量肉湯稀釋法［3，14］進行測定，設置實驗組、陰性對照組、陽性對照組、空白對照組。取無菌96 孔板，在A1～A11 孔中分別加入1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 g／L 藥材提取液100 μL，再分別加入100 μL 稀釋至1×104倍的白色念珠菌菌液，使每孔終質量濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 g／L，作為實驗組；B1～B11孔中依次加入質量濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 g／L 藥材提取液100 μL，再分別加入100 μL 改良馬丁液體培養基，作為陰性對照組；A12 孔中加入滅菌水、稀釋至1×104倍的菌液各100 μL，作為陽性對照組；B12 孔中加入滅菌水、改良馬丁液體培養基各100 μL，作為空白對照，每組平行3 次，將96 孔板置于酶標儀中測定600 nm 波長下的吸光度（A），計算抑菌率，公式為抑菌率＝［1-（A實驗組-A陰性對照組） ／（A陽性對照組-A空白對照組）］ ×100%。

2.4 藥材指紋圖譜數據及抑菌效果 藥材指紋圖譜數據以各標志峰峰面積與內標物峰面積的比值表達，抑菌效果以供試品溶液質量濃度為7.81 g／L 時的抑菌率來表達（7.81 g／L為藥材抑制白色念珠菌的最低抑菌濃度，此時4 種提取方式下的抑菌率具有顯著差異），結果見表1。

2.5 灰色關聯分析 參考文獻［7，15-16］ 報道的方法。

2.5.1 參考序列、比較序列確定 本實驗考察不同提取工藝下藥材提取液中各成分（即各組分峰面積） 對白色念珠菌抑菌率的影響程度，以抑菌率為參考序列（母序列），記作X0（k），k＝1、2、3、4；以27 種成分峰比值為比較序列（子序列），記作Xi（k），i＝1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4。

2.5.2 無量綱化處理 為了確保實驗結果準確性，便于各指標比較，在計算灰色關聯度之前需要對數據進行無量綱化處理。本實驗研究采用均值化法，即用各序列元素分別除以相應序列平均值，計算公式為i＝0、1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4。其中為序列i的樣本數據平均值，Xi（k） 為原數據，Xi′ （k） 為無綱量化處理后的數據，從而得到均值化的序列｛Xi′ （k） ｝。

表1 藥材指紋圖譜數據及抑菌效果

2.5.3 求差數列建立 計算參比序列與比較序列的絕對差值ΔXi（k），計算公式為

2.5.4 關聯系數確定 灰色關聯系數ζi（k） 表示參考序列X0和比較序列Xi在k（k＝1、2、3、4） 時的關聯程度，計算公式為ξi（k）＝（i＝0、1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4），式中｜X0（k） -Xi（k） ｜ 為序列X0與序列Xi在k點差值的絕對值；為差值絕對值的二級最小值，即在各序列差值最小值的基礎上，進一步得出所有序列的差值最小值；為差值絕對值的二級最大值，即在各序列差值最大值的基礎上，進一步得出所有序列的差值最大值；ρ為分辨系數，取值區間為（0，1），本實驗取ρ＝0.5。

2.5.5 灰色關聯度計算 灰色關聯度γ0i計算公式為，式中n為任一序列i下的樣本數，本實驗取n＝4。

2.5.6 關聯極性分析 序列Xi′ （k） 與X0′ （k） 之間的關聯極性 σi計算公式為（i＝1、2、3、…、27，k＝1、2、3、4，n＝4）。若sgn （σi） ＝sgn （σ0），則Yi與Y0正關聯，即前者對后者起到增強作用；若sgn （σi） ＝-sgn （σ0），則Yi與Y0負關聯，即前者對后者起到削弱作用，sgn （X）為符號函數，即

2.6 分析結果 按“2.5” 項下方法對譜-效關系進行分析，結果見表2，可知除了成分1、3、8、10、12、14、21、22、26 對抑菌起到削弱作用外，其他成分都起到促進作用，各成分對抑菌率的影響程度見圖2～3。在促進抑菌活性的成分中，關聯度最強的是峰24 （黃芩素），其關聯度為0.768 9；對削弱抑菌活性的成分中，關聯度最強的是峰22，其關聯度為0.624 7，即峰24 （黃芩素）、峰22 分

表2 抑菌質量標志峰與抑菌率之間的關聯度

圖2 對抑制白色念珠菌起促進作用的成分及其貢獻程度

圖3 對抑制白色念珠菌起削弱作用的成分及其貢獻程度

3 討論

白色念珠菌是一種條件致病性真菌，是真菌感染的最常見原因之一，并且具有顯著的死亡率。黃芩具有顯著抑制白色念珠菌的活性，而且它屬于天然中藥產物，不易產生耐藥性，故本實驗旨在考察該藥材相關質量標志物。

中藥質量標志物（Q-marker） 是中藥質量控制的一個新概念，其核心內容包括有效、特有、傳遞與溯源、可測、處方配伍［17］，其中有效最為重要。目前，已有文獻表明黃芩苷、黃芩素等單體成分對白色念珠菌具有抑制作用［19-20］，本實驗印證了這一點，但更著重對黃芩提取物中各成分對抑菌效果的強弱進行研究，并將貢獻程度最大的黃芩素作為質量標志物。中藥是否有效與其化學成分、提取工藝等因素密不可分，故本實驗設置4 種提取方式使其化學成分及藥效（抑菌率） 具有顯著差異，以便通過譜-效關系確定該藥材抑制白色念珠菌的質量標志物。

中藥化學成分十分復雜，并非所有成分在疾病治療中都起著同樣重要的作用，故需應用一種合適的方法對譜-效關系進行研究，以便得到在藥效學中發揮作用的貢獻者。中藥譜-效關系的研究方法很多，如灰色關聯分析、相關分析、聚類分析、偏最小二乘法分析等，其中灰色關聯分析具有樣本量小、計算量小、結果與定量結果一致等優點［12］。因此，本實驗采用灰色關聯分析法對黃芩的“譜-效” 關系進行研究，發現其中抑制白色念珠菌關聯性最強的成分是黃芩素，而不是含有量最高的黃芩苷。因此，針對中藥中每種特定成分的藥效，均需要制定合適的方法對其譜-效關系進行分析，以便確定其質量標志物。

本實驗首次采用譜-效結合模式，從抑菌差異性特點的角度出發，對黃芩進行質量綜合評價體系研究，并通過灰色關聯分析對不同提取工藝所得黃芩HPLC 指紋圖譜與藥液對白色念珠菌的抑制作用進行關聯，明確了該藥材抑菌物質基礎的關聯程度。結果，初步確定了黃芩抑制白色念珠菌的主要質量標志物是黃芩素，其藥效發揮是多種成分共同作用的結果，可為該藥材提取工藝優化、質量控制建立等方面的研究提供可行性參考。但本實驗結果與目前黃芩質量控制指標（黃芩苷） 不完全符合，具體原因仍需進一步探討。