膠質母細胞瘤中circPITX1表達、功能及臨床意義

陸正 劉建剛

(1南通大學附屬海安醫院神經外科，江蘇 海安 226600；2蘇州大學第一附屬醫院神經外科)

膠質母細胞瘤(GBM)是一種高級別膠質瘤，是人類最致命的癌癥之一〔1,2〕。盡管手術、放療和化療等多種治療手段得到了長足發展，GBM患者的預后仍然很差，5年生存率不足5%〔3,4〕。GBM的發生和進展是一個復雜的過程，涉及多種分子和表觀遺傳學的變化〔5〕。因此，尋找與GBM發生發展相關的新的生物標志物將對了解GBM的疾病進程及評價疾病預后有很大幫助。環狀RNA(circRNA)是一類內源性RNA，不同于線性RNA，它的結構為一個共價閉合的連續環，而且往往比線性mRNA更加穩定〔6,7〕，以各種各樣的方式對基因表達起著調控作用。研究表明，circRNA在多種腫瘤中異常表達，可作參與各種腫瘤生物學進程〔8～10〕。

到目前為止，在GBM中有關circRNA的研究仍然很少。本研究使用circRNA高通量測序技術發現了一些在GBM中異常表達的circRNAs，同時選取表達差異最大的circRNA-hsa_circ_0074027進行研究，將其命名為circPITX1，并在GBM中驗證其表達、探尋其生物學功能及臨床意義。

1 材料和方法

1.1患者和組織樣本 GBM組織及相應正常腦組織(NBTs)共42對取自于南通大學附屬海安醫院進行手術的患者。本研究經醫院研究倫理委員會批準，且患者均簽署知情同意書，標本均經病理證實。

1.2circRNA測序 用TRIzol試劑(Invitrogen,USA)提取3對GBM組織和相應正常腦組織的總RNA。用RNase R試劑(Epicentre Technologies,USA)消化RNA，去除線性RNA，豐富circRNA。在Illumina HeSeq 2000平臺(Illumina，USA)上進行測序分析。測序結果用Cluster3.0軟件(University of Tokyo,Human Genome Center)進行分析。

1.3細胞培養及轉染 人GBM細胞系U251、U87、A172、LN229及正常人星形膠質細胞系NHA均來自美國ATCC公司。細胞均在DMEM培養基(Gibco，USA)中培養，輔以10%胎牛血清(Gibco)。所有細胞系在37℃，含5% CO2的濕潤環境中培養。采用Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen)將circPITX1 siRNA轉染入U251和LN229細胞；circPITX1 siRNA的靶序列為GCGUGCUAAGCACCUGGCGCA。

1.4RNA提取和qRT-PCR 用Trizol試劑(invitrogen)從GBM組織及細胞株中提取總RNA。逆轉錄試劑盒(Takara，日本)將RNA反轉錄為cDNA。qRT-PCR實驗使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Takara)，并在Roche LightCycler 480實時PCR系統(Apple BioSosies)上進行。用2-ΔΔCt法計算circPITX1相對表達量，以GAPDH為內參。引物序列如下：circPITX1-正義鏈:5'-CCATAGTCCGAGCGTGCTAA-3',circPITX1-反義鏈:5'-G-TCTGTCTTAAAGCGACAGCG-3'；GAPDH正義鏈:5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAAGT-3',GAPDH反義鏈:5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'。

1.5細胞增殖及遷移能力測定 使用特異性siRNA在GBM細胞中沉默circPITX1(circPITX1 siRNA組)，未沉默circPITX1為NC組，進行體外細胞功能實驗。在U251和LN229細胞中轉染circPITX1 siRNA測定細胞的增殖及遷移能力。用CCK-8試劑盒(beyotime，中國)測定細胞增殖活性。將U251和LN229細胞接種于96孔板中，密度為2×103/孔。在不同時間點，在每孔中分別加入100 μl無血清培養基和10 μl CCK-8溶液。然后將培養板在37℃下孵育1 h。在分光光度計上測量450 nm處的吸光度。細胞遷移能力采用劃痕實驗來評估。細胞在6孔培養板中培養至90%融合，用無菌的10 μl微量移液管尖端輕輕地劃傷附著的細胞，在單層細胞中形成一個劃痕(時間0 h)。隨后，用無血清培養基孵育細胞24 h，用顯微鏡拍攝細胞遷移情況。

1.6統計學分析 統計學分析運用SPSS20.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析比較組間差異；生存分析采用Kaplan-Meier法統計，單因素及多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。

2 結 果

2.1GBM組織中circRNA表達譜分析 9個circRNA表達明顯上調，8個circRNA表達明顯下調(差異倍數>2,P<0.05,圖1)。其中hsa_circ_0074027即circPITX1表達明顯上調，且差異倍數最大(差異倍數=8.34,圖1)。

2.2circPITX1在GBM組織和細胞系中高表達 GBM組織中circPITX1的表達量(2.608±1.207)明顯高于正常腦組織NBTs(1.279±0.704,P<0.05)。U251、U87、A172、LN229細胞系及NHA細胞系中circPITX1的表達分別為(2.593±0.065)、(1.790±0.111)、(2.377±0.070)、(2.793±0.169)、(0.997±0.085)。GBM細胞系中circPITX1的表達同樣上調(P<0.05)。證實circPITX1在GBM組織和細胞系中高表達。

2.3circPITX1水平與GBM患者臨床病理因素的相關性 根據用circPITX1相對表達量的中位數將42例GBM患者分為circPITX1高表達組(n=21)和circPITX1低表達組(n=21)，通過與患者臨床病理因素進行比較發現，circPITX1的表達與腫瘤直徑和遠處轉移相關(P<0.05)。見表1。表明circPITX1的表達量能夠提示GBM的進展情況。

圖1 GBM組織中circRNA表達譜

表1 circPITX1表達與GBM患者臨床病理因素關系(n)

臨床因素ncircPITX1高表達組circPITX1低表達組P值性別 男 女25171291380.753年齡 ≤60歲 >60歲30121471650.494腫瘤直徑 ≤5 cm >5 cm18245161380.013術前KPS(分) ≤70 >7016264171290.121IDH1突變 是5230.634 否371918腫瘤家族史 是8350.432 否341816遠處轉移 是171430.001 否25718

KPS：卡氏評分

2.4circPITX1水平與GBM患者預后的關系 如圖2所示， Kaplan-Meier生存分析結果表明，circPITX1高表達組GBM患者的總體生存時間明顯低于circPITX1低表達組(P<0.05)。因此， circPITX1的表達可作為預測GBM患者預后的生物學標志物。

圖2 circPITX1高表達組與低表達組GBM 患者的總體生存情況對比

2.5circPITX1水平是影響GBM患者預后的獨立危險因素 如表2所示，COX單因素分析表明術前KPS、遠處轉移和circPITX1水平是影響GBM患者預后的危險因素。而COX多因素分析表明，術前KPS和circPITX1是影響GBM患者預后的獨立危險因素。此結果表明circPITX1水平是影響GBM患者預后的獨立危險因素。

2.6circPITX1促進GBM細胞增殖和遷移 circPITX1促進GBM細胞增殖和遷移(P<0.05)，見表3、4，圖3。

表2 影響GBM患者總體生存的單因素及多因素分析

表3 兩組circPITX1表達及遷移活性比較

與NC組比較：1)P<0.05;下表同

表4 兩組培養不同時間細胞增殖情況比較

圖3 circPITX1 siRNA對U251和LN229細胞遷移的影響

3 討 論

隨著高通量測序技術的發展，越來越多的非編碼RNA被發現在腫瘤中異常表達。而circRNA作為新興分子，在近年來越來越受到關注。而且，研究辨明circRNA的異常表達在多種腫瘤的發生和進程中發揮重要作用。Cheng等〔11〕通過檢測肺鱗狀細胞癌中circRNA的表達譜發現circTP63表達上調，其上調與肺鱗狀細胞癌患者腫瘤大小和TNM分期有關，且circTP63在體內外都能促進細胞增殖；Jiao等〔12〕通過微陣列芯片發現hsa-circ-0000745在宮頸癌中高表達，并通過減少E-cadherin的表達，增強了細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

在GBM中，也有有關circRNA的相關研究，但很少。Xia等〔13〕的研究表明circ-AKT3在GBM組織中的表達降低，其編碼一種174個氨基酸，能夠降低GBM細胞的增殖能力、抗輻射能力和體內致瘤性;Lu等〔14〕報道circ_0001730通過mir-326/WNT7b軸激活wnt/β-catenin通路促進GBM細胞的生長和侵襲;Li等〔15〕通過檢測circRNA表達譜發現circ_0001946 在GBM細胞中表達降低，且證實circ_0001946 /miR-671-5p/CDR1通路對GBM的發生發展具有調節作用。因此，circRNAs可能通過多種方式參與了GBM的生物學進程，并在這些過程中可以作為生物學標志物提示GBM的疾病進程。

本研究結果表明，circPITX1在GBM組織和細胞中高表達并可促進GBM細胞增殖和遷移，其表達量可作為提示GBM的進展情況及預測GBM患者預后的生物學標志物，而具體的機制仍有待探究。