長鏈非編碼RNA HOTAIR在乳腺癌患者中表達及其臨床意義

高洪亮 邢福成

(天津市北辰醫(yī)院外科，天津 300400)

同源異型框基因翻譯基因間RNA(HOTAIR)，是目前研究較為透徹的長鏈非編碼RNA，其在人類多種實體腫瘤中呈現(xiàn)異常表達并可能與患者的預(yù)后和腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)〔1,2〕。長鏈非編碼RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度在200～100 000 nt之間的RNA分子，該RNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但其通過自身復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和龐大的種類發(fā)揮著包括表觀遺傳學(xué)調(diào)控在內(nèi)的多種生物學(xué)調(diào)控功能〔3〕。HOTAIR是新近發(fā)現(xiàn)的具有較多生物學(xué)功能的長鏈非編碼RNA，其參與了多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。HOTAIR可在分子層面對乳腺癌細胞組蛋白進行修飾，從而影響其侵襲轉(zhuǎn)移〔4,5〕。但HOTAIR表達水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系鮮有報道。本研究采用生物信息學(xué)分析HOTAIR在多個數(shù)據(jù)庫中的表達及高低表達與患者的預(yù)后關(guān)系；采用q-PCR法檢測乳腺癌患者癌組織中HOTAIR表達情況及其與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫選擇及分析 選取Oncomine(https://www.oncomine.org/)、Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)和TCGA數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)分析。在Oncomine數(shù)據(jù)入選限定條件為：乳腺癌；對比乳腺癌組織和正常乳腺組織中HOTAIR的差異表達情況；mRNA為表達水平；差異表達級別(logFC)大于2倍。在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)檢索乳腺癌數(shù)據(jù)集，計算無疾病進展生存，對腫瘤病理類型、臨床分期、分級等不作限制。TCGA數(shù)據(jù)庫選擇腺癌，且具有生存分析數(shù)據(jù)。

1.2組織標本 選擇天津市北辰醫(yī)院2015年1月至2018年12月收治并經(jīng)手術(shù)治療的乳腺癌患者72例，均為女性，平均年齡(56.8±12.6)歲。患者術(shù)前均未接受過放化療等新輔助治療。手術(shù)標本切除后，立即放入事先準備好的液氮罐中冷凍，再將組織置于-80℃冰箱保存，用于后期提取總mRNA。根據(jù)乳腺癌患者HOTAIR在腫瘤組織中表達水平的中位數(shù)，分為高表達組與低表達組。

1.3實時熒光定量PCR 采用Trizol試劑對乳腺癌組織、癌旁組織進行裂解，經(jīng)氯仿混合震蕩離心，再經(jīng)異丙醇沉淀，提取總RNA。應(yīng)用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Toyobo公司的SYBR GREEN MASTER MIX，在ABI 7500 96孔實時熒光定量PCR儀上進行實驗，定量檢測HOTAIR的表達情況。

1.4統(tǒng)計分析 采用Stata10.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、生存分析繪制生存曲線并進行l(wèi)og-rank檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HOTAIR在乳腺癌中的表達 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析顯示，HOTAIR在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)，見圖1。

A：HOTAIR在多種腫瘤中的表達情況；B:HOTAIR在2個芯片數(shù)據(jù)集中的表達；C:乳腺癌組織與正常乳腺組織中HOTAIR差異表達的柱狀圖圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析HOTAIR在乳腺癌中的表達情況

2.2HOTAIR表達與患者預(yù)后 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，高低表達組239153_at (HR=1.29,95%CI:0.94～1.76,P>0.05)和1557051_s_at(HR=0.92,95%CI:0.67～1.29,P>0.05)總生存期(OS)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但數(shù)據(jù)集進行分析239153_at呈現(xiàn)出高表達患者生存期較短的趨勢，見圖2。

2.3TCGA數(shù)據(jù)分析HOTAIR HOTAIR在乳腺癌中拷貝數(shù)異常率為0.1%， 見圖3。而HOTAIR表達水平在各種突變情況下差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖2 HOTAIR高低表達患者OS生存曲線

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中HOTARI表達

圖4 HOTAIR在2個數(shù)據(jù)集中的相對表達水平

2.4q-PCR驗證 癌組織中HOTAIR相對表達量(8.36±3.78)顯著高于癌旁組織(5.26±3.33，P<0.05)。高表達組生存期顯著低于低表達組(HR=1.45,9%CI:1.08～2.32,P<0.05)。

3 討 論

全球每年新發(fā)乳腺癌病例130 萬，死亡40 萬，乳腺癌已成為繼肺癌之后發(fā)病率及死亡率最高的實體腫瘤〔6〕。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為的研究不斷深入，越來越多的研究已從分子水平上證實乳腺癌是一種具有一定遺傳背景的疾病，患者基因水平上的改變在乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，早期乳腺癌可接受手術(shù)治療，預(yù)后較好5 年生存率可達90%以上，但已發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌預(yù)后較差〔7,8〕。因此，探尋乳腺癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的機制、早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移高危人群或高危相關(guān)因素，并加以預(yù)防和治療是提高乳腺癌預(yù)后的重要途徑之一〔9～11〕。

HOTAIR作為長鏈非編碼RNA的重要成員之一，與乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HOTAIR是HOXC基因簇的一條反義鏈，作為組蛋白修飾復(fù)合物的腳手架，其5′端結(jié)構(gòu)域與PRC2復(fù)合體結(jié)合，3′端結(jié)構(gòu)域與LSD1/CoREST/ REST復(fù)合體結(jié)合〔12〕。而HOTAIR能同時結(jié)合這兩個復(fù)合體，并將其募集到特異性的基因組位點，從而使該染色體處于封閉狀態(tài)而使其基因沉默〔13,14〕。Gupia等〔13〕首先采用基因芯片技術(shù)對乳腺癌細胞及正常細胞進行長鏈非編碼RNA表達譜的差異選擇，發(fā)現(xiàn)HOTAIR表達水平明顯高于正常乳腺細胞，進一步采用分子克隆技術(shù)和microRNA干擾技術(shù)將帶有HOTAIR基因的表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞(microRNA干擾其表達)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達HOTAIR基因的乳腺癌細胞其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯高于轉(zhuǎn)染前，microRNA干擾后乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降，在細胞學(xué)上證明HOTAIR與乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為有密切關(guān)系。本研究生物信息分析顯示HOTAIR高或低表達與患者的預(yù)后無關(guān)，但其中一個芯片數(shù)據(jù)集提示高表達患者已呈現(xiàn)總生存期較短的趨勢。進一步采用組織標本進行驗證，結(jié)果提示HOTAIR在乳腺癌中高表達，且與患者預(yù)后相關(guān)，可作為乳腺癌患者預(yù)后潛在的分子標志物。