基于網絡藥理學預測紅花治療心肌缺血的作用機制▲

謝 巍 楊 妮 肖 萍 黃艷玲

(廣西柳州市婦幼保健院藥學部，柳州市 545001，電子郵箱：915007149@qq.com)

發生心肌缺血時由于心臟血液灌注量減少導致供氧降低，能量代謝異常，從而無法維持心臟正常的功能[1]。血壓降低、冠狀動脈阻塞、炎癥、心瓣膜病、血黏度變化、心肌病變均會引發心肌缺血。臨床上，西醫對心肌缺血的治療重在改善供血、降低耗氧以及提高心肌組織對低氧的耐受性[2-3]。中醫將該病歸屬于“胸痹”范疇[4]，其主要病機為心脈痹阻，活血化瘀類中藥常用于心肌缺血的治療。紅花為菊科植物，性辛、溫，歸心、肝經，具有活血通經、散瘀止痛的功效，其主要的化學成分有黃酮類、甾體、酚酸類、雙醇、木脂素、查爾酮、炔類、揮發油等[5]。現代藥理研究表明，紅花具有顯著抗血栓、抗動脈粥樣硬化、改善血流動力學的作用[6-7]，其主要活性成分為紅花黃色素，能顯著減輕控制性降壓誘導的兔海馬缺血缺氧性損傷，可能是通過抑制神經型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)蛋白的表達而發揮作用[8]。但是，中藥發揮療效具有多成分、多靶點的特點，因此紅花抗心肌缺血的機制是多方面的，但現階段缺乏對紅花抗心肌缺血的藥效成分及作用機制的整體認識。 因此，探討紅花治療心肌缺血作用機制有十分重要的指導意義。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科。其將疾病的治療策略由一個靶點、一個藥治療轉變為多個靶點、多種組分治療，與中藥治病“整體性、多靶點”的原則相符合。本文通過網絡藥理學的方法構建紅花“成分-靶點-通路”網絡，分析紅花中有效成分治療心肌缺血的作用機制，尋找關鍵作用分子和信號通路， 為進一步實驗研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 紅花活性成分和作用靶點的篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索紅花的全部化學成分，再篩選口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(drug-likeness,DL)≥0.18[9]的有效成分。進一步利用該平臺查詢有效成分的作用靶點，并將篩選出的靶點標準化為Swiss-Prot 號和相應的簡稱。

1.2 心肌缺血疾病相關靶基因的收集 利用GeneCards數據庫平臺(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)和OMIM數據庫平臺(https://omim.org/)，檢索心肌缺血的相關靶基因。利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)，將獲得的基因信息標準化，刪除無人類樣本Uniprot ID的基因。

1.3 基因映射 將紅花中有效成分靶點和心肌缺血的相關靶基因進行基因映射(利用XLS表格進行基因映射對比)，從而獲取有效成分和疾病共同作用的靶基因；并用R3.5.0軟件VennDiagram包繪制維恩圖，確定共同作用的靶基因。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建 將紅花-心肌缺血共同作用靶點的基因上傳至STRING平臺(https://string db.org/) 構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡模型，最低相互作用閾值設為“medium confidence”(>0.4)，蛋白種屬設置為“Homo sapiens”，其他參數保持默認設置，獲得紅花-心肌缺血的PPI網絡。

1.5 網絡構建分析 利用Cytoscape v3.6.0軟件構建“化合物-靶點-通路”網絡圖，并計算網絡拓撲參數，將信號通路富集數量前20 位的靶點與該通路中的蛋白構建“靶點-通路”可視化網絡。在網絡中與1個節點相互作用的數目用度值表示，參與的生物功能越多則度值越大，表明在網絡中的重要性越大。

1.6 功能富集分析及通路富集分析 應用R 3.5.0軟件的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等安裝包進行基因本體(Gene Ontology,GO) 功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，將富集分析所預測的化學成分靶點(P≤0.05)進行可視化處理，進一步分析紅花治療心肌缺血的生物過程和信號通路，最終分別繪制 GO功能富集分析的條形圖和 KEGG 富集分析的氣泡圖和通路分析圖。

2 結 果

2.1 紅花的藥效成分及其作用靶點 共收集到紅花活性化合物189個，篩選出OB≥30%和DL≥0.18的高活性化合物共22 個， 分別對應得到化合物的作用靶點共1 466個。以自由度值表示預測出該成分與作用靶點的關聯個數，自由度值的大小即代表著在網絡中的關聯度，根據活性成分與作用靶點的關聯度(設定度值為>1)進一步篩選。因在數據庫中6個活性成分無作用靶點，最終篩選出 218個作用靶點。槲皮素(自由度=77)的作用靶點最多，其次為山柰酚(自由度=34)和木樨草素(自由度=28) 。在22個活性成分中有13個成分有2個或以上的靶點。見表1。

表1 紅花 中22個高活性化合物

2.2 “紅花-心肌缺血”共同靶點的篩選 共獲得531個心肌缺血疾病相關靶點，將這531個疾病靶點與218個紅花化學成分作用靶點相交集，獲得紅花-心肌缺血共同靶點39個，見圖1。

圖1 心肌缺血疾病相關靶點與紅花有效成分作用靶點的維恩圖

2.3 網絡模型的構建 將39個紅花-心肌缺血共同靶點構建網絡模型(見圖2)；結果顯示，紅花的13種藥效成分協同作用于39個心肌缺血靶點，其中與槲皮素對應的靶點達31個，與山柰酚對應的靶點有13個，說明槲皮素可能起到潛在關鍵作用。每個靶點均有2個以上的成分協同作用，其中，8種潛在藥效成分共同作用于過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)基因，10種潛在藥效成分共同作用于前列腺素內過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)基因。

圖2 “活性成分-作用靶點-相關疾病”網絡模型

注：三角形代表中藥紅花，菱形代表靶點，黃色橢圓形代表成分，紅色橢圓形代表心肌缺血疾病。

2.4 PPI分析 將39個紅花-心肌缺點共同靶點構建PPI網絡。該網絡包括39個節點，292條連線；每一條連線表示有一種證據證明兩個蛋白有互作關系；每一個節點表示一個蛋白，節點的顏色表示不同的連接證據；節點自由度的大小表示其在網絡中的重要性。在此基礎上篩選出30個關鍵節點(篩選標準：根據節點之間的連線多少進行篩選，篩選連線較多的30個節點為關鍵節點)，并繪制關鍵蛋白節點的條形圖；自由度較高的節點依次為白細胞介素(interleukin,IL)-6、白蛋白(albumin,ALB)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、體細胞細胞色素C(cytochrome c,somatic,CYCS)、MYC、NOS3、PPARG、Fos。見圖3、圖4。

圖3 共同靶點PPI網絡

圖4 PPI網絡關鍵蛋白節點條形圖

2.5 GO 功能富集分析 對紅花-心肌缺血的39個共同作用靶蛋白進行GO生物功能分析，確定對應的條目(P<0.05)， 繪制排名前20位的GO 條目，如圖5所示，圖中顏色越紅，表明功能富集越密集。共同作用靶點主要富集在激活轉錄因子結合、雌激素受體結合、半胱氨酸型內肽酶活性、核激素受體結合、DNA結合轉錄激活活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性等48個生物過程。這表明紅花可通過調控激活轉錄因子結合及雌激素受體結合等方面治療心肌缺血。見圖5。

圖5 GO功能富集分析條形圖

2.6 KEGG通路分析 對紅花-心肌缺血的39個共同作用靶蛋白進行KEGG通路富集分析，繪制排名前20位的KEGG氣泡圖(P≤0.05)，同時對篩選的核心通路加以注釋。氣泡圖中顏色與大小取決于關聯基因Count值和P值，紅色節點越大信號通路的顯著性就越高，說明該條信號通路的重要性越高。共同靶點主要富集于心肌缺血相關信號流體切應力和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、糖尿病并發癥的年齡憤怒信號、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎、南美錐蟲病、人巨細胞病毒感染等114個通路，這提示紅花通過作用于多條通路來治療心肌缺血，且這些通路間存在著復雜的相互作用關系。見圖6。

其中，IL-17通路由6個成員IL-17A～F組成，而IL-17受體家族由5個成員IL-17受體A～E組成。IL-17通路在自身免疫疾病的發病機制和癌癥方面有重要的意義，因此以IL-17通路為例繪制KEGG通路分析圖。由通路圖可知，使用紅花治療心肌缺血，可通過影響IKKa蛋白、IkBa蛋白、細胞外調節蛋白激酶1/2、凋亡信號分子(Caspase-3)轉錄激活AP-1因子，進一步影響CCL2、趨化因子(C-X-C基序)配體[chemokine(C-X-C motif)ligand，CXCL1]1、CXCL12趨化因子、IL-6、Fos等因子的表達，從而調控IL-17通路。見圖6、圖7。

圖6 KEGG通路富集氣泡

注：X軸表示關聯基因數占信號通路上總基因數的比例，Y軸表示通路名稱。

圖7 IL-17通路分析圖

3 討 論

心肌缺血是心臟供氧減少、心肌能量代謝不正常導致的一種病理狀態。現代醫學認為，心肌缺血是由于血壓降低、主動脈供血減少或者冠狀動脈阻塞導致的心臟供血減少，此外心瓣膜病、血黏度變化、心肌本身病變也會導致心肌缺血[10]。雖然目前對心肌缺血的認識不斷增加，但藥物治療心肌缺血的作用機制尚不完全明確，故基于網絡藥理學預測紅花單味中藥在治療心肌缺血中的作用機制和關鍵通路有重要意義。

本研究從網絡藥理學方法出發，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺收集了紅花中22種活性高化合物和1 446個靶點。另一方面，采用GeneCards數據平臺和OMIM數據庫數據平臺檢索得到531個心肌缺血相關靶點，并將兩者進行基因映射，獲得 39個共同基因靶點，并在此基礎上構建了PPI網絡。 通過網絡分析獲得木酚素、6-羥基甲醇、黃芩素、槲皮素等13種藥效成分，發現其協同作用于ESR1、PTGS1、PPARG、VEGFA、BCL2等39個心肌缺血靶點，這充分體現了中藥“多疾病”“多成分”“多靶點”的理論基礎。在“活性成分-作用靶點-相關疾病”網絡模型中可以看出，槲皮素對應的心肌缺血靶點最多，說明紅花中槲皮素在治療心肌缺血方面可能起到了關鍵作用。而現代藥理研究也表明，槲皮素及其代謝物具有顯著抗氧化、抗炎作用[11]，并且能調控心房鈉尿肽對心血管疾病產生影響[12]。進一步行GO功能富集分析 顯示，紅花治療心肌缺血的基因功能主要體現在雌激素受體結合、激活轉錄因子結合、半胱氨酸型內肽酶活性等方面；KEGG通路富集分析顯示紅花治療肺癌可能的信號通路為波西肉瘤相關皰疹病毒感染、糖尿病并發癥的年齡憤怒信號、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路。

本文通過網絡藥理學的方法，探索紅花治療心肌缺血潛在的關鍵靶基因及信號通路，或可為紅花的后續研發提供新的思路與方法。但本研究所得的結果仍存在不足之處，因此，在后期研究中還需臨床試驗證實通過數據挖掘預測得到的藥物作用和功能。其次，本研究在篩選OB和DL時也存在一些限制，僅選取了口服的藥物。而目前隨著藥物的制劑研發飛速發展，紅花提取物的注射劑已被廣泛應用于臨床。此外，在后期的新藥預測和研發中，口服利用度較低的成分也需要引起我們的重視，可能潛在有更廣泛的治療作用[13]。