沒食子酸對放射性肺損傷大鼠的保護作用

吳鵬飛 邱立志 張麗麗 白金鳳 滕懷遠 薛培麗

(四川省科學城醫院呼吸與危重癥醫學科，綿陽市 621000，電子郵箱：461951469@qq.com)

接受胸部放療的患者中，有50%～100%的患者影像學表現為肺組織受損，有50%～90%的患者存在亞臨床的肺功能下降，而多達30%的患者發生有臨床癥狀的肺損傷。由此可見，放射性肺損傷(radiation-induced lung injury，RILI)已成為胸部放療患者最常見的并發癥之一，嚴重地影響放療效果及患者生存質量。然而，目前對于RILI仍無有效治療措施，因此亟須尋找新的治療手段[1-2]。沒食子酸是一種常見的多酚類化合物，來源廣泛，易于制取，其生物毒性低，半數致死量高達5 g/kg[3]。其具有較強的抗炎、抗氧化、抗纖維化及促進腫瘤細胞凋亡等作用[4]。研究顯示，沒食子酸能抑制PM10導致的大鼠心臟組織局部腫瘤壞死因子α、白細胞介素(interleukin,IL)-6升高，并能改善心臟射血分數[5]。因此，沒食子酸具有較大的臨床應用潛力。目前，有關沒食子酸改善RILI的研究報告較為罕見。本研究探討沒食子酸灌胃對RILI大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級SD大鼠36只[成都達碩實驗動物公司，批號：SCXK(chuan)2014-189]，雄性，6周齡，體重200 g左右。6只/籠，自由飲水、攝食，光照節律12 h/12 h。

1.2 主要試劑 沒食子酸(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%，批號：S30153)，用0.9%氯化鈉配制成30 mg/mL的工作液；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液(武漢博士德生物公司，批號：AR1180)；Masson染液(北京索拉寶科技有限公司，批號：G1340)；大鼠IL-6、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海將來實業股份有限公司，批號：JL20896；JL12342)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：A030-2-1)；兔抗大鼠α 平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(美國CST公司，批號：19245)；山羊抗兔IgG(上海碧云天公司，批號：A0208)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及RILI大鼠模型的建立：采用隨機數字表法將36只大鼠分為對照組、RILI組、RILI+沒食子酸組各12只。RILI組、RILI+沒食子酸組大鼠參照文獻[6]建立RILI模型。4%戊巴比妥(1 mL/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定，照射野上界為兩側腋窩中點的連線、下界為劍突下緣平面，鉛板遮擋其余部位，6MV-X線直線加速器(美國Varian公司)單次雙肺照射，劑量20 Gy，源皮距 100 cm，由放療科協助完成。對照組不做處理。

1.3.2 干預方法：從照射后第1天開始，RILI+沒食子酸組給予2 mL 沒食子酸(濃度為30 mg/mL)灌胃，RILI組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，對照組不做任何處理。灌胃持續至照射后第28天。在照射后第4周末及第8周末，每組處死6只大鼠，取血清檢測IL-6、TGF-β1水平；取左肺檢測肺系數；取部分右肺組織，固定后行HE染色及Masson-Trichrome 染色，觀察病理改變，并行免疫組化染色觀察α-SMA表達；部分右肺組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，檢測羥脯氨酸含量。

1.3.3 肺系數的檢測：稱體重后處死大鼠，取左肺，生理鹽水輕柔漂洗，濾紙吸干表面水分，稱重，記為肺濕重，肺系數=肺濕重(mg)/體重(g)×100，用于評估肺水腫程度。

1.3.4 肺組織病理學改變的觀察：取部分右肺組織，4%多聚甲醛加壓固定72 h，行HE染色、Masson-Trichrome染色，觀察病理改變，并采用Szapiel法[7]行肺泡炎評分及纖維化評分。

1.3.5 血清IL-6、TGF-β1水平的檢測：經腹主動脈取血3 mL，4℃離心15 min(5 000 r/min)，取上清1 mL，按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，酶標儀(美國熱電公司 ，型號：51119770DP)檢測450 nm處的吸光度值。

1.3.6 肺組織羥脯氨酸含量的檢測：-80℃冰箱取出凍存右肺組織，稱取80 mg，按照羥脯氨酸試劑盒說明書操作，堿水法測定肺組織中羥脯氨酸含量，用于評估組織纖維化程度。

1.3.7 肺組織α-SMA表達水平的檢測：肺組織石蠟切片常規脫蠟、脫水，3%過氧化氫清除內源性過氧化物酶，檸檬酸鹽修復抗原，封閉液封閉，孵一抗，4℃過夜，孵二抗，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素輕染，鏡下觀察肺組織α-SMA表達強度。陽性判斷標準：鏡下可見棕黃色、褐色區域，則為表達陽性。

1.4 統計學分析 運用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠肺系數比較 在照射后第4周末、第8周末，與對照組比較，RILI組及RILI+沒食子酸組大鼠肺系數均增高，而RILI+沒食子酸組大鼠肺系數低于RILI組(均P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠不同時間點肺系數比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.2 3組大鼠肺組織病理學改變 HE染色顯示，對照組大鼠肺泡結構正常，肺泡間隔未見明顯細胞滲出；IRLI組大鼠在照射后第4周末可見部分肺泡結構紊亂，腔內見液體滲出，肺泡間隔增寬，細胞滲出增加，在第8周末肺泡炎性改變有所減輕，部分肺泡阻塞、融合，肺泡間隔增寬更加明顯，部分區域細胞成分減少；與RILI組比較，RILI+沒食子酸組大鼠上述病理改變減輕。RILI組第8周末的肺泡炎評分低于第4周末(t=9.667,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組大鼠肺泡炎評分均高于對照組，而RILI+沒食子酸組評分低于RILI組(均P<0.05)。見圖1和表2。

Masson-Trichrome 染色顯示，對照組大鼠肺組織未見明顯藍色膠原纖維沉積；在照射后第4周末，RILI組大鼠在大氣道、大血管附近可見少許藍色膠原纖維，在第8周時膠原生成及沉積范圍增加；與RILI組比較，在各時間點RILI+沒食子酸組大鼠的膠原生成減少。RILI組第8周末的纖維化評分高于第4周末(t=9.027,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組大鼠纖維化評分均高于對照組，而RILI+沒食子酸組評分低于RILI組(均P<0.05)。見圖2和表2。

圖1 3組大鼠肺組織HE染色(×200)

圖2 3組大鼠肺組織Masson染色(×200)

表2 3組大鼠肺泡炎及纖維化評分比較(x±s,分)

注：與對照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.3 3組大鼠血清IL-6、TGF-β1水平比較 與照射后第4周末比較，第8周末RILI組的血清IL-6水平降低(t=16.133，P<0.001)，而TGF-β1水平升高(t=15.790，P<0.001)。在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組血清IL-6及TGF-β1水平均高于對照組，而RILI+沒食子酸組血清IL-6及TGF-β1水平均低于RILI組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠不同時間點血清IL-6和TGF-β1水平比較(x±s,pg/mL)

注：與對照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.4 3組大鼠肺組織羥脯氨酸含量比較 RILI組第8周末肺組織中羥脯氨酸含量高于第4周末(t=9.649,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組肺組織羥脯氨酸含量均高于對照組，而RILI+沒食子酸組肺組織羥脯氨酸含量低于RILI組(均P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠不同時間點肺組織羥脯氨酸含量比較(x±s,μg/mg)

注：與對照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.5 3組大鼠肺組織肌成纖維細胞激活情況 在照射后第4周末、第8周末，對照組大鼠肺組織中均未見明顯棕黃色陽性表達區域。在照射后第4周末，RILI組肺組織可見α-SMA陽性表達增加，在第8周末陽性表達區域明顯增加。在同一時間點與RILI組比較，RILI+沒食子酸組肺組織α-SMA陽性表達區域明顯減少。見圖3。

圖3 3組大鼠肺組織α-SMA表達水平(免疫組化染色，×200)

3 討 論

沒食子酸化學名3,4,5，-三羥基苯甲酸，天然存在于綠茶、杧果、葡萄等多種植物內。既往研究顯示，沒食子酸具有抗炎、抗纖維化等多種功效。例如，Jin等[8]發現，沒食子酸可以通過抑制結締組織生長因子表達及Smad3磷酸化水平，改善心衰誘導的肺纖維化；Nikbakht等[9]在研究博來霉素誘導肺纖維化大鼠模型時發現，給予沒食子酸連續灌胃28 d可以顯著地降低博來霉素導致的血腫瘤壞死因子 α、IL-1β表達水平。而關于沒食子酸對RILI有無保護作用，目前鮮有研究報告。本實驗對大鼠雙肺進行X線照射以建立RILI模型，照射后大鼠的肺系數、肺泡炎及肺纖維評分均增高，結合肺組織病理改變，符合RILI的表現，提示建模成功。我們進一步使用沒食子酸灌胃RILI模型大鼠，以觀察沒食子酸的干預效果。

RILI是由靶細胞受損后異常修復、細胞因子釋放及氧化應激等多方面共同參與的復雜過程，病理上以早期炎癥性改變及后期纖維化為特點[10]。持續的炎癥反應可以加重肺損傷，促進肺纖維化。IL-6、TGF-β1與RILI發生與發展的關系密切。研究顯示，在RILI動物模型及臨床RILI患者中，血IL-6、TGF-β1水平均異常增高，且這兩項指標具有預測RILI發生風險的作用[11]。IL-6可刺激巨噬細胞、淋巴細胞激活，從而間接增強TGF-β1的促炎、促纖維化能力[6]。TGF-β1能促進成纖維細胞的活化并表達α-SMA，并刺激膠原與纖維結合素生成，導致異常的、大量的細胞外基質蓄積。在RILI早期，TGF-β1水平即明顯升高，纖維化后期階段仍持續高表達，具有很強的促纖維化能力[12]。本實驗結果顯示，在照射后第4周末，RILI組大鼠血清IL-6、TGF-β1水平明顯升高，且第8周末TGF-β1水平繼續增高；而經過沒食子酸處理后，RILI+沒食子酸組大鼠血IL-6、TGF-β1水平以及肺泡炎及肺纖維評分均低于RILI組，肺組織HE染色及Masson染色顯示肺組織早期炎癥反應及后期纖維化均明顯改善。這表明沒食子酸能夠抑制RILI大鼠全身及局部炎癥反應，改善肺組織的纖維化，從而發揮肺保護作用。

激活的成纖維細胞可以“正反饋”刺激成纖維細胞活化，促進TGF-β1等炎性分子分泌，及基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶組織抑制因子失衡，使得細胞外基質大量生成[13]。而α-SMA表達增加是成纖維細胞增殖的重要標志，抑制α-SMA表達可減少成纖維細胞的激活，從而減輕纖維化。Yue等[14]發現，經照射后豬肺組織中α-SMA表達增加，纖維化程度加重。Cao等[15]發現，虎杖苷能顯著地抑制RILI小鼠肺組織中α-SMA的表達，從而減少膠原蛋白沉積。羥脯氨酸在膠原蛋白中特異性表達，因此檢測肺組織中羥脯氨酸含量可推測肺纖維化的嚴重程度。本實驗結果顯示，在照射后第4周末，RILI組肺組織的α-SMA陽性表達及羥脯氨酸含量均增加，在第8周末進一步增加；而經沒食子酸灌胃后，RILI+沒食子酸組肺組織α-SMA陽性表達區域明顯減少，羥脯氨酸含量降低。這提示沒食子酸或通過抑制RILI大鼠肺組織中α-SMA的表達以及減少羥脯氨酸生成，從而發揮抗纖維化作用。

綜上所述，沒食子酸對RILI大鼠具有肺保護作用，而這可能是通過減輕炎癥反應、抑制成纖維細胞激活實現的，其具體機制有待后續進一步研究。