高效液相色譜法測定土壤中6種鄰苯二甲酸酯的含量及其生物有效性的評價

劉成霞，朱 洋，劉綠葉

(上海實樸檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200100)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類常用的塑化劑，可增加塑料的柔韌性和強度，因此廣泛應(yīng)用于食品包裝、兒童玩具、化妝品、紡織品和生物醫(yī)學(xué)設(shè)備等軟質(zhì)塑料中[1-3]。PAEs可通過多種途徑污染環(huán)境，如大氣、飲用水、土壤、食品包裝材料等，土壤中的塑化劑主要來源于農(nóng)膜及其他廢棄塑料制品的攜入。PAEs及其代謝產(chǎn)物和降解產(chǎn)物對人體健康的危害很大，不但會損傷人體肝臟、腎臟、生殖器官，還會干擾人體正常內(nèi)分泌，影響體內(nèi)荷爾蒙含量，長期在體內(nèi)積累還可能會導(dǎo)致畸形、癌變和細胞突變[4-6]。美國環(huán)保署將6 種PAEs列為優(yōu)先控制的重點污染物，包括鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)。塑化劑的測定主要集中在塑料容器以及塑料包裝材料中，但近年來，一些不法商販利用塑化劑的增塑特點將塑化劑代替起云劑和乳化劑加入到食品，甚至藥品中[7]。對土壤中塑化劑的測定及其生物有效性的同步研究較少。

土壤中的PAEs能夠被植物和無脊椎動物吸收，并通過食物鏈在動物和人體內(nèi)累積，食物中的污染物從食品基質(zhì)中釋放后進入消化液，由上皮細胞轉(zhuǎn)入靜脈，繼而轉(zhuǎn)移到靶器官發(fā)揮毒性作用[8]。體外胃腸模擬法可以利用人工配制的消化液，模擬人體的胃和腸的消化過程來分析污染物的生物有效性[9-11]。通常只有部分有機污染物溶解在胃腸液中，這部分被認為是可能被人體吸收，即生物有效態(tài)的部分[12]。測定土壤中有機污染物的生物有效性對評價其暴露風(fēng)險至關(guān)重要[13]。本工作以體外胃腸模擬法為基礎(chǔ)，分析土壤中PAEs的生物有效性，為評價其健康風(fēng)險和污染管控提供依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，配可變波長紫外檢測器；梅特勒S220型p H 計；0.45μm 有機過濾膜。

6種PAEs混合標準儲備溶液:100 mg·L－1。

胃液:稱取1.25 g胃蛋白酶，0.50 g蘋果酸鈉，0.50 g檸檬酸鈉，加入420μL 乳酸和500μL 乙酸溶解后，用乙酸定容至1.000 L，并用50%(體積分數(shù))鹽酸溶液調(diào)節(jié)p H 至2.5[14]。

甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

Zorbax Eclipse C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)，柱溫40 ℃；進樣體積20μL；流量1 m L·min－1；測定波長245 nm。流動相:A 為乙腈，B 為水。梯度洗脫程序:0～5 min 時，A 為70%；6～10 min時，A 由70%升至95%，保持10 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

分別稱取10.000 g土壤樣品于2個50 m L 玻璃瓶中，第一份樣品中加入10 m L 胃液，在37 ℃下，以100 r·min－1轉(zhuǎn)速振蕩提取1 h，模擬胃液的消化過程。胃液提取結(jié)束后，用碳酸氫鈉(粉末)調(diào)節(jié)消化液p H 至7.0，加入55.0 mg膽汁鹽和15 mg胰液素即得腸液，然后在37 ℃下，以100 r·min－1轉(zhuǎn)速繼續(xù)振蕩2 h，完成腸液的提取。提取結(jié)束后，以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液加入10 m L甲醇，超聲提取30 min。按同樣方法操作進行空白試驗。另一份樣品中加入10 m L甲醇，超聲提取30 min，按同樣方法操作進行空白試驗。反應(yīng)結(jié)束后向兩份提取液中加入足量硫酸鎂和氯化鈉，以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液定容至10.0 m L，經(jīng)0.45μm 有機濾膜過濾后按色譜條件進行測定。

1.3.2 生物有效性計算

污染物的生物有效性的計算見公式(1):

式中:xB為污染物的生物有效性；ρ1為污染物從基質(zhì)中釋放到胃腸模擬液中的質(zhì)量濃度，mg·L－1；ρ2為基質(zhì)中污染物的總質(zhì)量濃度，mg·L－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對10.0 mg·L－1的6種PAEs混合標準溶液進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 6種PAEs混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 6 PAEs

2.2 色譜條件的選擇

試驗以乙腈-水二元溶劑體系為流動相，采用了Zorbax Eclipse C18色 譜 柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)分離，經(jīng)過反復(fù)試驗，摸索出有效分離6種PAEs的梯度洗脫程序，并考察了不同流量對分離6種PAEs的影響。初始，乙腈與水的比例為70∶30，以5 m L·min－1速率將乙腈的比例升至95%；因DMP和DEP 的保留時間較接近，控制流量為1 m L·min－1，在10 min 內(nèi) 可 有 效 分 離DMP、DEP、BBP；在10～20 min 時，保持乙腈的比例為95%，DBP 和DEHP 的保留時間相差較大，可在20 min內(nèi)分離6種PAEs。選擇合適的梯度洗脫程序，可有效降低基線漂移對6種PAEs的影響，獲得較好的分離效果。試驗選擇的流量和梯度洗脫程序見1.2節(jié)。

2.3 標準曲線和檢出限

移取適量的100 mg·L－16種PAEs混合標準儲備溶液，用 乙腈稀釋成0.10，0.50，1.00，2.50，5.00，10.0 mg·L－1的6種PAEs混合標準溶液系列，按色譜條件進行測定，以6種PAEs的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，繪制標準曲線。結(jié)果表明:6種PAEs的質(zhì)量濃度均在0.10～10.0 mg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的色譜峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

按色譜條件對2.50 mg·L－1的6種PAEs混合標準溶液進行測定，計算7次平行測定的標準偏差，按照公式(2)計算方法的檢出限:

式中:XMDL為方法檢出限；n 為樣品的平行測定次數(shù)；t 為自由度為n－1，置信度為99%時的t 分布(單側(cè))；s 為n 次平行測定的標準偏差。當n＝7，置信度為99%時，t＝3.143。方法的檢出限結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.4 精密度和回收試驗

按試驗方法對土壤標準樣品(HTSB-4)、地表土壤樣品、農(nóng)田土壤樣品進行分析，均未檢出6 種PAEs。對上述土壤樣品進行加標回收試驗，平行測定7 次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝7)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝7)

由表2可知:回收率為95.6%～96.4%，RSD 為0.22%～0.56%。

2.5 土壤中PAEs的生物有效性

對土壤標準樣品(HTSB-4)加標(加標量為1.00 mg·L－1)，其生物有效性結(jié)果見表3。

由表3可知:不同PAEs的生物有效性存在一定差別。PAEs脂溶性越高，其生物有效性越低。其主要原因為目前體外胃腸模擬法是基于污染物在介質(zhì)和消化液中的平衡分配原理進行的，污染物的生物有效性與其辛醇-水分配系數(shù)有關(guān)。在體外胃腸模擬試驗中，沒有足夠的親脂性物質(zhì)提供吸附力使得親脂性有機污染物由固體顆粒釋放到胃腸模擬液中，從而降低了它的轉(zhuǎn)化。

表3 土壤中6種PAEs的生物有效性Tab.3 Biological availability of 6 PAEs in soil

2.6 土壤理化參數(shù)對PAEs生物有效性的影響

影響污染物對土壤生物毒性的因素主要包括:礦物質(zhì)種類(影響化合物吸附)、粒徑分布(影響表而積)、水含量(影響化合物分配和可利用性)、滲透度(影響傳輸能力)、結(jié)構(gòu)(影響孔隙率)、酸度、溫度、金屬含量、含碳有機質(zhì)(TOC)、孔隙率(影響滲透性)、密度(決定孔體積，受土壤中礦物質(zhì)含量和種類、有機質(zhì)、土壤結(jié)構(gòu)影響)、無機離子、污染歷史等[15]。試驗對某地土壤進行了研究，分析方法參照《全國土壤污染狀況詳查土壤樣品分析測試方法技術(shù)規(guī)定》第三部分《土壤理化性質(zhì)分析測試方法》。結(jié)果表明:某地土壤樣品中DEHP 檢出率較高，主要原因在于DEHP是應(yīng)用最為廣泛的增塑劑，其辛醇-水分配系數(shù)較高，不易降解，易被土壤吸附，同時其生物有效性較低，造成持久性污染。土壤理化性質(zhì)與生物有效性的相關(guān)性見表4。

由表4可知:待測土壤樣品生物有效性與含水率、濕密度成反比，與TOC 有一定的相關(guān)性，這與文獻[16]研究結(jié)果一致。

本工作采用高效液相色譜法測定土壤中6 種PAEs的含量，方法精密度高、準確可靠。同時以體外胃腸模擬法分析土壤中PAEs的生物有效性。人體胃腸道具有復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)，當食物等介質(zhì)進入以后，污染物不斷從介質(zhì)上解吸附下來，然后被胃腸道吸收。但在靜態(tài)的體外胃腸模擬試驗中，達到消化平衡后，并沒有存在像活體一樣的吸收過程，這會限制污染物從介質(zhì)上的解吸附。因此，這種基于平衡分配原理的靜態(tài)體外模擬試驗測得的生物有效性可能會低于活體試驗測得的生物有效性。本工作為PAEs體內(nèi)代謝提供前期參考，在后續(xù)的研究中建議采用液相色譜-質(zhì)譜法或同位素示蹤法對體內(nèi)代謝物進行分析，并結(jié)合毒性因子，完善評價土壤中PAEs生物有效性的方法。

表4 土壤理化性質(zhì)與生物有效性的相關(guān)性Tab.4 Correlation between physical and chemical properties of soil and biological availability