呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒中TREM-1/DAP12通路關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)的表達(dá)

彭 程，黎金雨，趙 云，余 莉

(1. 四川省廣安市人民醫(yī)院兒科，四川 廣安 638000； 2. 四川省遂寧市第一人民醫(yī)院兒科，四川 遂寧 629000； 3. 成都兒童專(zhuān)科醫(yī)院兒科，四川 成都 610015； 4. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科，四川 成都 610041)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是小兒毛細(xì)支氣管炎最常見(jiàn)的病原體，RSV感染患兒較副流感病毒、肺炎支原體等非RSV感染患兒的預(yù)后差，目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治療措施。RSV感染后炎癥調(diào)節(jié)紊亂是影響病毒清除與疾病病程的重要原因，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞的不斷浸潤(rùn)以及細(xì)胞因子的大量分泌，在發(fā)揮抗病毒作用的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷[1]。因此，深入探討RSV感染后炎癥紊亂的病理機(jī)制具有重要的臨床意義。

髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)可以與下游接頭分子DNAX活化蛋白12(DNAX-activating protein 12，DAP12)相互作用，激活炎癥信號(hào)通路[2-4]。TREM-1在不同種類(lèi)微生物感染中可能發(fā)揮不同作用，如在流感病毒感染模型中TREM-1基因缺失可降低炎癥水平[5]；在銅綠假單胞菌感染中發(fā)現(xiàn)TREM-1基因缺失可促進(jìn)炎癥因子分泌[6]。但是，TREM-1在RSV毛細(xì)支氣管炎患兒中的表達(dá)及作用目前尚無(wú)報(bào)道，因此，本文旨在探討TREM-1、DAP12在RSV毛細(xì)支氣管炎患兒中的表達(dá)，并構(gòu)建RSV感染人支氣管上皮(normal human bronchial epithelial cells，NHBE)細(xì)胞模型，以深入研究相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月—2019年1月四川省廣安市人民醫(yī)院RSV毛細(xì)支氣管炎患兒為病例組，共67例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤2歲；(2)符合《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專(zhuān)家共識(shí)(2014年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(3)采用鼻咽拭子采集呼吸道分泌物，病原學(xué)檢查為RSV單一感染；(4)入院前1個(gè)月內(nèi)未經(jīng)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療；(5)入院前病程在3 d內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肺結(jié)核、免疫缺陷病、先天性疾病等。

根據(jù)入院lowell評(píng)分，將病例組分為輕癥組(臨床評(píng)分≤9分，共39例)和重癥組(臨床評(píng)分≥10分，共28例)。選取同期體檢的健康兒童作為對(duì)照組，共35例。本研究已獲四川省廣安市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 血清中炎癥因子含量的檢測(cè) 治療前，經(jīng)肘正中靜脈穿刺采集靜脈血0.5 mL，分離血清，分裝后保存于-80℃冰箱。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)含量。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞中TREM-1、DAP12 mRNA的檢測(cè) 治療前，經(jīng)肘正中靜脈穿刺采集EDTA抗凝靜脈血2 mL，使用人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列為：TREM-1上游引物，5’-GAACTCCGAGCTGCAACTAAA-3’；下游引物，5’-TCTAGCGTGTAGTCACATTTCAC-3’。DAP12上游引物，5’-GAGACCGAGTCGCCTTATCA-3’；下游引物，5’-GTCATGATTCGGGCTCATTT-3’。

1.4 PBMCs中TREM-1、DAP12蛋白質(zhì)的檢測(cè) 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)檢測(cè)PBMCs中TREM-1、DAP12蛋白質(zhì)表達(dá)量。常規(guī)進(jìn)行蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)印等步驟，一抗(英國(guó)Abcam公司)稀釋比例為：TREM-1(1∶1 000)、DAP12(1∶500)、GAPDH(1∶3 000)。上述試驗(yàn)均在四川省廣安市人民醫(yī)院完成。

1.5 細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)

1.5.1 主要試劑 NHBE細(xì)胞、人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)均購(gòu)自美國(guó)ATCC；RSV病毒(A亞型)購(gòu)自廣州博特生物工程有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectin-2000TM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.5.2 細(xì)胞與病毒培養(yǎng) NHBE細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將RSV病毒接種至Hep-2細(xì)胞，培養(yǎng)3～5 d后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融獲取病毒懸液，根據(jù)Reed-muench法測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)。細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)均于四川大學(xué)華西第二醫(yī)院完成。

1.5.3 RSV感染 將NHBE細(xì)胞接種于6孔板，待匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，依次加入滴度為0、50、100、500 TCID50的RSV病毒懸液，放置于37℃培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄去上層懸液，PBS洗滌2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集細(xì)胞，WB檢測(cè)不同滴度RSV誘導(dǎo)時(shí)NHBE細(xì)胞中TREM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，在滴度為100 TCID50的誘導(dǎo)條件下，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，然后收集細(xì)胞，WB檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間NHBE細(xì)胞中TREM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.5.4 RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道，設(shè)計(jì)針對(duì)人TREM-1的siRNA序列，具體序列為：siRNA-TREM-1正義鏈，5’-CCGGTG GCAGATAATAAGGGACGGCTCGAGCCGTCC CTTATTATCTGCCTTTTTG-3’；siRNA-TREM-1反義鏈，5’-AATTCAAAAAGGCAGATAATA AGGGACGGCTCGAGCCGTCCCTTATTATCT GCCA-3’。siRNA-Control正義鏈，5’-CCGGTGG GAAGTACGGAGTAAACGCTCGAGCGTTTA CTCCGTACTTCCCTTTTTG-3’；siRNA-Control反義鏈，5’-AATTCAAAAAGGGAAGTACG GAGTAAACGCTCGAGCGTTTACTCCGTACT TCCCA-3’。將上述寡核苷酸單鏈退火后，克隆至pGenesil-1.1質(zhì)粒。使用Lipofectin-2000TM將測(cè)序正確的siRNA-Control質(zhì)粒和siRNA-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NHBE細(xì)胞。

1.5.5 試驗(yàn)分組 細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、RSV感染組、RSV+siRNA-Control組、RSV+siRNA-TREM-1組。對(duì)照組、RSV感染組使用未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的NHBE細(xì)胞，RSV+siRNA-Control組和RSV+siRNA-TREM-1組分別使用siRNA-Control質(zhì)粒和siRNA-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NHBE細(xì)胞。對(duì)照組不進(jìn)行RSV感染，其余3組均使用滴度為100 TCID50的RSV感染，誘導(dǎo)時(shí)間為48 h。

1.5.6 檢測(cè)指標(biāo) RSV感染48 h后，收集各組細(xì)胞及上清液，使用qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中TREM-1、DAP12 mRNA表達(dá)，使用WB檢測(cè)各組細(xì)胞中TREM-1、DAP12蛋白表達(dá)水平，使用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子的含量，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1。

使用免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞中TREM-1蛋白表達(dá)水平，具體步驟為：4%多聚甲醛固定30 min，封閉1 h，滴加抗TREM-1抗體(1∶50)4℃過(guò)夜。二抗孵育、DAPI染色、封片等步驟后拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料 病例組共67例RSV毛細(xì)支氣管炎患兒，其中輕癥組39例，重癥組28例。輕癥組中男性21例，女性18例，平均年齡(9.16±4.22)個(gè)月；重癥組中男性13例，女性15例，平均年齡(9.45±4.63)個(gè)月。對(duì)照組共35例健康兒童，其中男性18例，女性17例，平均年齡(9.28±4.06)個(gè)月。三組兒童性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2 各組兒童血清中炎癥因子含量的比較 輕癥組和重癥組兒童血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均高于對(duì)照組，且重癥組IL-1β、IL-8、IL-17、HMGB1含量高于輕癥組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組兒童PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA及其蛋白的表達(dá)變化 輕癥組和重癥組兒童PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA及蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組，且重癥組高于輕癥組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

2.4 RSV誘導(dǎo)NHBE細(xì)胞表達(dá)TREM-1蛋白情況 隨著RSV濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的增加，NHBE細(xì)胞中TREM-1的表達(dá)量逐漸升高，RSV濃度為100 TCID50以及誘導(dǎo)時(shí)間為48 h時(shí)，TREM-1的表達(dá)量達(dá)到最高。見(jiàn)圖3。

表1 各組兒童血清中炎癥因子含量的比較(pg/mL)

注：a表示與對(duì)照組比較，P<0.05；b表示與輕癥組比較，P<0.05。

A：qRT-PCR檢測(cè)TREM-1 mRNA表達(dá)；B、C：WB檢測(cè)TREM-1蛋白表達(dá)。1：對(duì)照組；2：輕癥組；3：重癥組。a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與輕癥組比較，P<0.05。

圖1 各組PBMCs中TREM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

Figure 1 Expression level of TREM-1 mRNA and protein in PBMCs of each group

A：qRT-PCR檢測(cè)DAP12 mRNA表達(dá)；B、C：WB檢測(cè)DAP12蛋白表達(dá)。1：對(duì)照組，2：輕癥組，3：重癥組。a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與輕癥組比較，P<0.05。

圖2 各組PBMCs中DAP12 mRNA和蛋白表達(dá)水平

Figure 2 Expression level of DAP12 mRNA and protein in PBMCs of each group

A：WB檢測(cè)不同感染滴度下TREM-1的蛋白表達(dá)；B：WB檢測(cè)不同感染時(shí)間下TREM-1的蛋白表達(dá)。a：與0 TCID50(或0 h)比較，P<0.05；b：與50 TCID50(或24 h)比較，P<0.05。

圖3 RSV誘導(dǎo)NHBE細(xì)胞表達(dá)TREM-1蛋白水平

Figure 3 Expression level of TREM-1 protein in NHBE cells induced by RSV

2.5 TREM-1沉默對(duì)TREM-1表達(dá)的抑制效果 RSV感染組、RSV+siRNA-Control組中TREM-1 mRNA和蛋白量均高于對(duì)照組和RSV+siRNA-TREM-1組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。RSV感染組、RSV+siRNA-Control組的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組和RSV+siRNA-TREM-1組，見(jiàn)圖5。

A：qRT-PCR檢測(cè)TREM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；B、C：WB檢測(cè)TREM-1蛋白表達(dá)。1：對(duì)照組；2：RSV感染組；3：RSV+siRNA-Control組；4：RSV+siRNA-TREM-1組。a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與RSV感染組比較，P<0.05；c：與RSV+siRNA-Control組比較，P<0.05。

圖4 各組NHBE細(xì)胞中TREM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平

Figure 4 Expression level of TREM-1 mRNA transcription and protein in NHBE cells of each group

1：對(duì)照組；2：RSV感染組；3：RSV+siRNA-Control組；4：RSV+siRNA-TREM-1組。

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)各組NHBE細(xì)胞中TREM-1表達(dá)情況

Figure 5 Expression of TREM-1 in NHBE cells by immunofluorescence staining of each group

2.6 TREM-1沉默對(duì)DAP12表達(dá)的影響 RSV感染組、RSV+siRNA-Control組中DAP12 mRNA和蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組和RSV+siRNA-TREM-1組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。 RSV+siRNA-TREM-1組中DAP12 mRNA和蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

2.7 TREM-1沉默對(duì)炎癥因子分泌的影響 RSV感染組、RSV+siRNA-Control組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。RSV+siRNA-TREM-1組的上述炎癥因子含量均低于RSV感染組、RSV+siRNA-Control組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。RSV+siRNA-TREM-1組的IL-8、IL-17、HMGB1炎癥因子含量高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

A：qRT-PCR檢測(cè)DAP12 mRNA表達(dá)；B、C：WB檢測(cè)DAP12蛋白表達(dá)。1：對(duì)照組；2：RSV感染組；3：RSV+siRNA-Control組；4：RSV+siRNA-TREM-1組。a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與RSV感染組比較，P<0.05；c：與RSV+siRNA-Control組比較，P<0.05。

圖6 各組NHBE中DAP12 mRNA和蛋白表達(dá)水平

注：a表示與對(duì)照組比較，P<0.05；b表示與RSV感染組比較，P<0.05；c表示與RSV+siRNA-Control組比較，P<0.05。

3 討論

TREM-1是Bouchon等人于2000年首次發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白，是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子。盡管目前尚未明確鑒定出TREM-1配體，但間接證據(jù)表明損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)和病原相關(guān)分子模式(PAMPs)可活化TREM-1，從而誘導(dǎo)炎癥因子分泌[9]。此外，TREM-1其他功能的發(fā)現(xiàn)，如促進(jìn)T細(xì)胞增殖，激活抗原呈遞細(xì)胞，表明TREM-1蛋白在調(diào)節(jié)宿主對(duì)病原微生物的免疫反應(yīng)中發(fā)揮更重要的作用[10]。

最初研究[11]認(rèn)為T(mén)REM-1主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，僅在膿毒癥等細(xì)菌感染疾病中發(fā)揮免疫效應(yīng)。但近年研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，TREM-1也表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等組織細(xì)胞表面，參與病毒感染以及無(wú)菌性炎癥。Yuan等[14]在研究人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)在巨噬細(xì)胞中的隱匿機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIV可通過(guò)NFκB信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)TREM-1，增強(qiáng)其抗凋亡能力，而沉默TREM-1表達(dá)則可上調(diào)Caspase 3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，認(rèn)為靶向沉默TREM-1可能提高HIV的清除率。然而，TREM-1在其他種類(lèi)病毒感染中的作用仍知之甚少，在RSV毛細(xì)支氣管炎患兒中的表達(dá)情況及作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。

炎癥因子的大量釋放是RSV感染與機(jī)體免疫屏障相互作用的結(jié)果，也是加重肺部病理?yè)p傷的原因之一，血清中炎癥因子含量與患兒預(yù)后密切相關(guān)[15]。因此，本文首先對(duì)RSV毛細(xì)支氣管炎患兒血清中炎癥因子含量進(jìn)行檢測(cè)，ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明RSV毛細(xì)支氣管炎患兒血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均顯著升高，而且與病情程度有關(guān)。此外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TREM-1 mRNA和蛋白在PBMCs中的表達(dá)量也顯著升高，與炎癥因子的升高趨勢(shì)一致，提示TREM-1可能參與RSV致炎機(jī)制。TREM-1的胞漿結(jié)構(gòu)域缺乏信號(hào)基序，其功能效應(yīng)主要依賴(lài)于下游接頭分子DAP12傳遞[16]，因此，TREM-1與DAP12的表達(dá)趨勢(shì)常保持一致，本文研究結(jié)果顯示，DAP12 mRNA和蛋白在PBMCs中高表達(dá)，也證實(shí)了上述結(jié)論。TREM-1/DAP12信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥因子釋放的因果關(guān)系并不恒定，兩者可能相互作用，共同誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大。部分研究結(jié)果可間接支持這一結(jié)論，例如：HMGB1可能是TREM-1的配體[17]；NFκB不僅是TREM-1/DAP12誘導(dǎo)炎癥因子釋放的下游信號(hào)通路，也可上調(diào)TREM-1表達(dá)，沉默NF-κB p65可抑制HIV相關(guān)蛋白Tat或者gp120對(duì)TREM-1表達(dá)的誘導(dǎo)作用[14]。

為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論，本文構(gòu)建了RSV感染NHBE的體外細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSV可通過(guò)濃度和時(shí)間依賴(lài)的方式誘導(dǎo)TREM-1高表達(dá)。以往研究大多認(rèn)為，TREM-1主要通過(guò)炎癥細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，如增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)炎癥因子分泌等[18]。本文通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)TREM-1進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)TREM-1沉默可以下調(diào)DAP12表達(dá)，降低炎癥因子分泌，進(jìn)一步證實(shí)TREM-1是RSV感染后炎癥失調(diào)的關(guān)鍵分子，為RSV毛細(xì)支氣管炎治療提供了新的靶點(diǎn)。

綜上所述，TREM-1/DAP12信號(hào)通路在RSV毛細(xì)支氣管炎患兒中高表達(dá)。RSV誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞高表達(dá)TREM-1，沉默TREM-1可以下調(diào)DAP12表達(dá)，降低炎癥因子分泌。