紫外可見分光光度法測定膠囊劑中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的含量

劉士團，張 芳，劉春霖

(1.臨沂海關綜合技術服務中心，山東 臨沂 276037；2.山東省魯南眼科醫(yī)院，山東 臨沂 276002； 3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

鹽酸氨基葡萄糖又稱D-氨基葡萄糖鹽酸鹽，是甲殼素經鹽酸降解后生成的一種還原糖[1-2]，進入人體后在胃內轉化成游離的氨基葡萄糖而被身體利用[3]。氨基葡萄糖主要存在于機體的關節(jié)軟骨中，可刺激軟骨細胞產生正常多聚體結構的蛋白多糖，在一定程度上阻斷骨性關節(jié)炎的病理發(fā)展過程，從而起到抗炎、改善關節(jié)功能的作用，對骨性關節(jié)炎具有很好的療效[4-8]。在我國，氨基葡萄糖以鹽酸鹽、硫酸鹽的形式申報為基本藥物，以甲殼素、軟骨素成份申報為保健食品。氨基葡萄糖是一種天然的氨基單糖，由于不穩(wěn)定，一般被制成鹽酸鹽的形式以延長其穩(wěn)定性[9]。D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對人體有重要的生理功能，是保健食品和合成抗生素的主要原料[10]。目前D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的測定方法主要有滴定分析法[11]、比色法[12]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[13-15]等。本文采用《新藥轉正標準》第64冊“國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS1-(X-090)-2005Z鹽酸氨基葡萄糖膠囊”方法，對膠囊劑中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的含量進行測定。該方法準確度高，靈敏度好，操作簡便快速，適用于膠囊劑中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Mettler Toledo Ms十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用公司)；恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑試藥

乙酰丙酮、無醛乙醇、碳酸鈉、對二甲氨基苯甲醛、鹽酸，均為分析純；水，超純水。

乙酰丙酮試液：取乙酰丙酮2 mL，加0.5 mol/L碳酸鈉溶液至50 mL，臨用前配置。

對二甲氨基苯甲醛試液：稱取對二甲氨基苯甲醛0.8 g，加無醛乙醇15 mL及鹽酸15 mL，搖勻。

D-鹽酸氨基葡萄糖對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號140649-201304，純度100%。

對照品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的D-鹽酸氨基葡萄糖對照品10.13 mg，置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，備用。精密量取1.0 mL標準儲備液，用水定容至10 mL，濃度為101.3 μg/mL，作為對照品溶液。

樣品：某醫(yī)藥公司提供，三批編號分別為1、2、3。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的提取

精密稱取混合均勻的供試品內容物約0.07 g，置100 mL量瓶中，加水使鹽酸氨基葡萄糖溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的測定

精密量取供試品溶液3.0 mL，分別置25 mL具塞比色管中，補加水至5 mL，加乙酰丙酮試液1 mL，搖勻，置沸水浴中加熱25 min，取出，用冰水迅速冷卻后，加無醛乙醇3.0 mL，60℃水浴中保溫10 min，再加對二甲氨基苯甲醛試液1.0 mL，強烈振搖，繼續(xù)在60℃水浴中保溫1 h，冷卻至室溫。用紫外分光光度計在525 nm波長處以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿測定供試品溶液吸光度值。計算，即得。

2.2 標準曲線溶液的制備及線性關系考察

精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置25 mL具塞比色管中，加水至5 mL，以下按“供試品溶液的測定”進行操作。用紫外分光光度計在525 nm波長處以試劑空白溶液為參比，測定吸光度值。以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽質量(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程為Y=0.00707X-0.07932，相關系數(shù)r=0.9991。結果表明，D-氨基葡萄糖鹽酸鹽在20.26～121.56 μg范圍內，線性關系良好。

2.3 重復性試驗

精密稱取同一批號混合均勻的供試品內容物6份，每份約0.07 g，置100 mL容量瓶中，以下按“供試品溶液的制備”進行操作。計算D-氨基葡萄糖鹽酸鹽平均含量為33.4 g/100g，RSD為0.90%。結果表明，該方法重復性良好。

2.4 加標回收率試驗

精密稱取同一批號混合均勻的供試品內容物9份，每份約0.035 g，做低、中、高(0.07 g樣品含量的80%、100%、120%)三個水平的加標試驗，每個水平3份樣品。分別加入D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品適量，以下按“供試品溶液的制備”進行操作，計算平均回收率，結果見表1。

表1 加標回收率試驗結果

結果表明，加標試樣的回收率為101.8%～103.4%，回收率良好。

2.5 檢出限

參照GB/T 5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗方法 理化部分 總則》中附錄A.2.2規(guī)定，檢出限為3倍空白值的標準偏差(測定次數(shù)n≥20)相對應的質量，吸光法按國際理論與應用化學家聯(lián)合(IUPAC)規(guī)定。檢出限按下式進行計算：檢出限=Ks/b；b-標準曲線回歸方程中的斜率，/μg；s-20次空白值的標準偏差；K-一般為3。結果見表2。

表2 檢出限試驗結果

2.6 精密度試驗

取標準曲線第四點顯色后的溶液，按上述方法連續(xù)測定6次吸光度，計算平均吸光度為0.511，RSD為0.10%。結果表明，精密度良好。

2.7 樣品含量測定

表3 樣品測定結果

精密稱取三批混合均勻的供試品內容物約0.07 g，置100 mL量瓶中，以下按“供試品溶液的制備”進行操作。計算樣品中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量，結果見表3。

通過對該方法線性范圍、重復性試驗、加標回收率試驗、檢出限、精密度試驗、樣品含量測定等方面進行驗證，結果表明，該方法適用于膠囊劑中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的測定。

3 討論

D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的現(xiàn)有檢測方法很多，但尋求一種適用性廣，且快速、簡單、準確的分析方法是我們的研究目標。現(xiàn)行有效的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽國標檢測方法為GB/T 20365-2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定 液相色譜法》，該方法以C18柱為分離柱，192 nm為檢測波長。因目標化合物極性較大，所以出峰時間較早，和樣品中的雜質峰、溶劑峰保留時間接近，而且部分制劑因輔料的影響難以分離，所以該方法對流動相和色譜柱的要求很高。本研究采用的紫外可見分光光度法，所需儀器設備簡單、實驗成本低，但需要嚴格控制時間、溫度等實驗條件。有文獻報道，液相色譜串聯(lián)質譜檢測法(LC-MS/MS)在D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的定量檢測中取得了諸多進展，后續(xù)可對該方法做進一步的研究。