氨氮及氨基氮檢測方法的選擇及改進

張興同

(青島尚德生物技術有限公司實驗室，山東 青島 266000)

氨氮是以游離氨和銨離子形式存在的氮，是無機氮；氨基氮一般是指以有機自由基團形式存在的氮，大多為有機物中，比如氨基酸中的氮。甲醛滴定法和乙酰丙酮比色法[1]一般用于氨基氮的測定，納氏試劑比色法[2]通常用于氨氮的測定。

經過理論分析與實驗驗證發現，如樣品未經蒸餾等前處理過程，三種方法檢測的均為氨氮與氨基氮的總量。

1 方法的選擇

通過對檢測準確度、耗時、反應條件和試劑用量及危害四個方面的實驗和理論對比發現：納氏試劑比色法準確度高、批量檢測耗時少，操作簡便、靈敏度高、試劑用量少且危害小，是微生態發酵生產過程檢測最合適的方法。

1.1 準確度

圖1 三種方法準確度對比

通過圖1可以看出，甲醛滴定法和納氏試劑比色法相對于乙酰丙酮法在檢測結果準確度上具有較大優勢。

1.2 檢測耗時

表1 三種方法檢測耗時對比

由表1可以看出：檢測單一樣品三種方法檢測所需時間差距不大，而八個樣品同時檢測耗時差距明顯。此外甲醛滴定法全程無停頓時間，而比色法可以利用反應時間(10 min或15 min)做一些其它耗時較少的工作。

1.3 反應條件

表2 三種方法反應條件對比

通過表2對比可以看出納氏試劑比色法對反應條件要求較低，操作更為簡便。

1.4 有毒有害試劑種類、用量及揮發性

從表3可以看出：甲醛滴定法有害試劑用量最大，乙酰丙酮法用到兩種有毒有害試劑且沸水浴會促進揮發，故兩種方法試劑危害都較大；納氏試劑比色法有害試劑用量少，而且反應溫度低(室溫)，氯化汞溶液微量揮發，危害最小。

表3 有毒有害試劑種類、用量及揮發性

1.5 小結

對比檢測準確率、耗時、反應條件、有毒有害試劑用量及危害，可得出結論：納氏試劑比色法批量檢測耗時少，對反應條件(溫度、pH、反應時間)要求不高，試劑用量少且危小，通過補償校正減小色度與濁度的影響準確度也有了很大提高，是生產過程檢測最合適的方法。

2 納氏試劑比色法方法的改進

2.1 試劑的配置與貯存

2.1.1 納氏試劑的配置與貯存

國標[2]中納氏試劑有兩種配制方法：HgCl2-KI-KOH和HgI2-KI-NaOH，徐立生等對兩種方法進行了多方面的對比[3]得出結論：兩種方法均能滿足檢測需要，方法一雖然配置較為麻煩，但試劑汞含量低，在靈敏度、準確度、空白值、檢出限等方面均優于方法二，因此從“清潔分析，節能減排”的理念出發，配置納氏試劑首選方法為HgCl2法，而HgI2法納氏試劑可用于應急檢測。

通過計算及參閱成春芳等對納氏試劑配制方法的探討[4]發現：方法一氯化汞和碘化鉀的加入比例應由HJ535-2009方法中為2.5∶5減少2.1∶5，攪拌溶解后，改為滴加飽和二氯化汞溶液繼續攪拌，至出現微量朱紅色沉淀不再溶解時，停止滴加飽和二氯化汞溶液。

納氏試劑配置過程反應如下:

(1)HgCl2+2KI=HgI2↓(紅色)+2KCl

(2)HgI2+2KI=K2[HgI4](溶解)

(3)2[HgI4]2-=2[HgI3]-+2I-

(4)2I-+ HgCl2(過量)=HgI2↓(紅色)+2Cl-

顯色基團為[HgI4]2-，它的生成與I-濃度密切相關，開始時，Hg2+與I-按反應(1)式生成紅色沉淀HgI2，迅速與過量I-按反應(2)式生成[HgI4]2-，淡黃色顯色基團；當紅色沉淀不再溶解時，表明I-不再過量，應立即停止加入HgCl2，此時可獲得最大量的顯色基團。若繼續加入HgCl2，反應(3)式和(4)式就會顯著進行，促使顯色基團不斷分解，同時產生大量HgI2紅色沉淀，從而引起納氏試劑靈敏度的降低。

HgCl2-KI-KOH溶液納氏試劑配制的首選方法，該方法關鍵在于把HgCl2的加入量，這決定著獲得顯色基團含量的多少，進而影響方法的靈敏度。方法未給出HgCl2的確切用量，需要根據配制過程中的現象加以判斷，經驗性強，較難把握。我們依據上述反應原理，根據 (1)式和(2)式得出HgCl2與KI的最佳用量比為0.41∶1。

配置好的試劑應貯存于聚乙烯瓶內，冰箱冷藏保存。

2.1.2 酒石酸鉀鈉溶液的配置與貯存

酒石酸鉀鈉溶液配制方法較為簡單，但某些分析純的酒石酸鉀鈉銨鹽含量略高，只靠加熱煮沸并不能完全除去，可采取向酒石酸鉀鈉溶液中加少量堿，煮沸蒸發后，冷卻并定容，也可向定容后的酒石酸鉀鈉溶液中加入少量納氏試劑，沉淀后取上層清液使用[5]。室溫放置時，酒石酸鉀鈉溶液最多放置30 d，否則會是空白值偏高且不穩定，在冰箱中冷藏，放置時間可達半年，且空白值無明顯增大[6]。

2.2 反應條件的確定

2.2.1 顯色時間

國標法中僅提到“放置10 min后測定”，在實際的大批量檢測分析工作中，因無終止反應的操作，很難控制在剛好反應10 min進行比色，因而確定顯色時間對測定結果的影響十分有必要。經實驗測定，在室溫(20～30℃)下顯色不足10 min，吸光度會隨顯色時間的增加而增大，而10～25 min后的吸光度無明顯變化，因此顯色時間控制在10～25 min之間即可。

2.2.2 溫度

溫度會影響納氏試劑與氨氮和氨基氮的反應速度，進而影響測定結果，選擇顯色時間10 min，溫度在低于15℃時顯色不完全，吸光度明顯低于20到30℃之間反應的吸光度，而高于30℃，吸光度會略微降低。因而無需對反應溫度進行嚴格的控制，在氣溫較高或較低時在空調間進行實驗即可。

2.2.3 反應體系pH

R-NH2+2[HgI4]2-+3OH-=[Hg2O·R-NH]I+2H20+7I-

由反應公式可知，OH-濃度影響反應平衡，因而反應需在較強堿性環境下才能進行完全，而微生物發酵液如未經酸化處理，稀釋到檢測倍數后基本為中性，納氏試劑中OH-含量較高(15%或16%)，樣品稀釋液加入酒石酸鉀鈉和納氏試劑后反應體pH值均大于11.8[6-7]，為堿性環境，反應體系中OH-含量遠大于氨氮及氨基氮含量，故檢測微生物發酵液中的氨氮和氨基氮除酸化處理后的樣品外無需調pH。

2.3 干擾因素的影響及消除

2.3.1 色度與濁度

因比色法是一種基于顯色反應所產生的顏色對透光度具有吸收的性質的方法，若待測樣自身帶有顏色或渾濁則會對結果產生影響，如何消除色度與濁度干擾，是準確測定的關鍵。經實驗驗證：對渾濁且色度深的微生態發酵液進行檢測時，納氏試劑法可以通過補償校正[8]消除色度與濁度的干擾：空白除不加顯色物質碘汞酸鉀外，其它與分析水樣完全相同。

2.3.2 金屬離子

鈣、鎂、鐵離子可與試劑中的強堿產生沉淀，對顯色反應產生影響，顯色前加酒石酸鉀鈉可絡合鈣、鎂，避免干擾。

2.3.3 Cl-

當反應體系中氯離子含量達到接近氨氮和氨基氮含量兩倍時[9]才開始對測量結果產生影響，而微生物發酵液中氯的含量要遠低于氨氮和氨基氮的量，故無需加硫代硫酸鈉來消除氯離子的干擾。

3 結語

理論分析和實驗證實納氏試劑比色法批量檢測耗時少、準確度較高、對反應條件(溫度、pH、反應時間)要求不高、試劑用量少危害小，是最適合微生物發酵樣品的批量檢測的方法。通過補充說明和改進，納氏試劑比色法試劑的配置和貯藏、反應條件(溫度、時間和pH)的控制和干擾因素對測定結果的影響，方法的細節得到了優化，準確度得到了提高。

此外，納氏試劑比色法除了能應用于微生物發酵樣品中氨氮和氨基氮含量的檢測，還可應用于污水中氨氮的測定、氨水含量的測定，另外通過微波消解等手段還可用于食品中蛋白質含量的測定。