逍遙丸對皮質酮誘導小鼠抑郁樣行為的干預機制※

●王雙雙 易立濤▲ 董淑琦 李成付 陳學勤

抑郁癥是一種情緒障礙，伴隨著悲傷、絕望、情緒低落、失眠、興趣低下等，為目前全球三大疾病負擔之一[1]。目前臨床常用抗抑郁藥物（如三環類）均為化學藥物，只能緩解部分癥狀，且作用位點單一，毒副作用較大，因此，研究開發療效好、毒副作用少的抗抑郁藥物成為近些年來研究的熱點[2]。

逍遙丸出自宋代《太平惠民和劑局方》，方中的柴胡可以疏肝解郁，以順肝性；當歸、白芍能養肝血，柔肝體，幫助柴胡恢復肝正常的順達之性；白術、茯苓可以益氣健脾，促進氣血生化；甘草則配合茯苓、白術以益氣健脾，配白芍以緩急止痛；薄荷辛涼，助柴胡以疏肝氣、解郁熱；煨姜辛溫，助柴胡、薄荷疏肝，助茯苓、白術以健脾胃[3]。因其具有疏肝解郁、健脾養血的功效，常作為中醫調理情志病的經典藥方。近年來研究顯示逍遙丸具有一定的抗抑郁作用[4]，本文則以皮質酮誘導的小鼠抑郁模型進一步探討逍遙丸基于改善神經營養系統的抗抑郁機制。

1 材料

1.1 藥物鹽酸氟西汀（購自常州四藥制藥有限公司）；皮質酮（購自美國Sigma-Aldrich 公司）；逍遙丸（購自北京同仁堂科技發展股份有限公司）。

1.2 動物雄性ICR 小鼠，清潔級，體重（22±2）g，8周齡，購自上海斯萊克動物中心，實驗動物許可證：SCXK（滬）2012-002。小鼠10 只/籠，室溫（22±2）°C，光暗周期為12 h/12 h（光照時間07:00-19:00），自由獲得飼料與飲水，適應環境一周后開始實驗。

1.3 試劑BDNF ELISA試劑盒（購自上海生工生物有限公司）；小鼠皮質酮ELISA試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 儀器電子分析天平（購自北京賽多利斯儀器系統有限公司）；超聲波清洗器（購自昆山市超聲儀器有限公司）；酶標儀（購自美國Thermo 公司）；臺式冷凍離心機（購自德國KENDRD公司）。

2 方法

2.1 動物模型的建立適應環境7 天后，所有的小鼠隨機分為5組（每組10只）：正常組、皮質酮組、逍遙丸組（低劑量及高劑量組的劑量分別為200mg/kg、600 mg/kg）、陽性對照氟西汀組（劑量為20 mg/kg）。皮質酮用0.1%的二甲亞砜和0.1 % 的吐溫-80 混合液溶解；逍遙丸和氟西汀混懸于生理鹽水中。除了正常組，其它組每天皮下注射皮質酮（40 mg/kg），持續35天。逍遙丸和氟西汀于皮質酮注射前30 min 灌胃給藥，劑量為10 ml/kg，實驗持續35天。

2.2 糖水偏好實驗實驗之前，先對小鼠進行糖水適應性訓練：先給予小鼠兩瓶1%蔗糖水，24 h 后，將其中一瓶換為普通水，再進行24 h。糖水適應之后，將小鼠進行水食剝奪24 h。糖水實驗在上午9點半開始，每只小鼠置于單獨的一個籠子中，分別給予一瓶1%蔗糖水，一瓶普通水（均已稱初重）。經過24 h，稱量兩個水瓶的末重，記錄每只小鼠消耗的糖水及普通水的量，計算糖水偏好百分比[公式：糖水偏好百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+普通水消耗量）]。

2.3 強迫游泳實驗將小鼠置于溫度（25±2）°C、水深10 cm 的圓形玻璃容器（高20 cm，直徑18 cm）中強迫游泳6 分鐘。判定不動的標準是小鼠在水中停止掙扎，呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面。通過實驗視頻，記錄小鼠在后4分鐘的總不動時間。

2.4 血液和組織樣本的獲取強迫游泳實驗后，摘小鼠眼球快速收集血液，4℃下4000 rpm 離心10 min，收集血清，-80℃貯存。然后，斷頭處死小鼠，快速取出海馬，立即用液氮凍結。所有的組織樣本在-80℃下貯存至分析完成。

2.5 血清皮質酮水平的測定根據皮質酮ELISA試劑盒說明書測定血清皮質酮濃度。

2.6 海馬腦源性神經營養因子（BDNF）水平測定根據BDNF ELISA試劑盒說明書測定其濃度。

2.7 數據分析所有的數據用均數±標準差（）表示，用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。統計差異用單因素方差分析結合事后檢驗進行分析。

3 結果

3.1 糖水偏好測定結果給藥5 周后，皮質酮組小鼠的糖水偏好值顯著低于正常組（P＜0.01），提示皮質酮引起小鼠的快感缺失。逍遙丸高、低劑量組及陽性對照氟西汀組均能顯著增加小鼠的糖水偏好值，與皮質酮組相比差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01），但逍遙丸高、低劑量組與陽性對照氟西汀組相比亦存在顯著差異（P＜0.05）。見表1。

表1 逍遙丸和皮質醇對小鼠糖水偏好值的影響（n=10，-x±s）

3.2 強迫游泳實驗測定結果相對于正常組，皮質酮組的不動時間顯著增加（P＜0.05）。與皮質酮組相比，低、高劑量逍遙丸和氟西汀均能顯著減少小鼠的不動時間（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表2 逍遙丸和皮質酮對小鼠強迫游泳實驗中不動時間的影響（n=10，）

表2 逍遙丸和皮質酮對小鼠強迫游泳實驗中不動時間的影響（n=10，）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與皮質酮組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.3 皮質酮測定結果皮質酮組小鼠血清中的皮質酮濃度顯著增高，與正常組相比具有統計學差異（P＜0.01）。與皮質酮組相比，低、高劑量逍遙丸組及陽性對照氟西汀組均可顯著降低小鼠血清中的皮質酮含量（P＜0.01）。見表3。

3.4 BDNF 測定結果與正常組相比，皮質酮組海馬BDNF 含量顯著降低（P＜0.01）。與皮質酮組相比，低、高劑量逍遙丸組和陽性對照氟西汀組均可增加小鼠海馬中BDNF的含量（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表3 逍遙丸和皮質酮對小鼠血清皮質酮含量的影響（n=10，）

表3 逍遙丸和皮質酮對小鼠血清皮質酮含量的影響（n=10，）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與皮質酮組比較，**P＜0.01

表4 逍遙丸和皮質酮對小鼠海馬中BDNF含量的影響（n=10，）

表4 逍遙丸和皮質酮對小鼠海馬中BDNF含量的影響（n=10，）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與皮質酮組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4 討論

本實驗采用糖水偏好實驗和強迫游泳實驗來觀察皮質酮對小鼠產生的快感缺失和絕望行為，以及逍遙丸是否具有改善的作用。結果發現，在糖水偏好實驗中，皮質酮顯著降低了小鼠對糖水的偏好，陽性對照氟西汀組的糖水偏好得到了顯著改善，服用逍遙丸也可以增加抑郁小鼠的糖水偏好值；在強迫游泳實驗中，皮質酮顯著增加了小鼠的不動時間，而與皮質酮組相比，逍遙丸組和氟西汀組的不動時間均得到了顯著降低。這一點與之前報道的加味逍遙丸能夠縮短小鼠在強迫游泳中的不動時間不謀而合[5]。

本實驗結果表明，注射皮質酮導致小鼠血清皮質酮濃度顯著升高，而氟西汀和逍遙丸均可逆轉其濃度。長期或者急性高度應激會使體內的糖皮質激素達到一個極高的水平，導致海馬損傷[6]。而經過氟西汀和逍遙丸治療，可以有效調節血清皮質酮的含量穩定，避免大腦海馬受到過多的損傷。

BDNF 作為神經營養素家族的主要成員，源于神經元及其靶細胞并逆向影響神經元。抑郁患者海馬BDNF 含量明顯低于正常人，傳統抗抑郁藥及電休克治療均可增加BDNF 含量，從而改善抑郁癥狀，提示BDNF可作為抗抑郁藥的治療靶點和檢測指標[7-8]。本實驗中，皮質酮組的小鼠海馬BDNF 含量明顯低于正常組，說明皮質酮降低了小鼠海馬中的BDNF 含量。而氟西汀、逍遙丸均可增加小鼠海馬中的BDNF 含量，與皮質酮組相比存在明顯差異，表明氟西汀和逍遙丸的抗抑郁作用與改善海馬神經營養系統有關。

中醫學認為疾病不是單獨發生于某個部位的病變，而是一個有機整體的病變。抑郁癥屬于中醫的情志疾病，從中醫學角度來講，抑郁癥不僅僅是某個部位的病變，它很大程度上與肝的功能相關[9]。逍遙丸中的柴胡可以疏肝解郁，在中醫學看來，逍遙丸是通過補肝體、助肝用、理氣養血、調和肝脾而起到改善抑郁的作用[10]。本研究結果表明逍遙丸確實能提高大腦海馬BDNF 的含量，至于其是否通過調理小鼠肝的功能，改善肝對皮質酮水平的調節，從而影響了海馬中神經遞質的表達水平，可作為下一步研究的方向。

綜上所述，長期注射皮質酮能夠降低正常小鼠的糖水偏好值以及增加強迫游泳的不動時間，產生抑郁樣的行為，并可增加血清皮質酮含量以及降低海馬BDNF 含量。相反，逍遙丸能夠逆轉皮質酮誘導的小鼠抑郁樣行為，并且能夠降低血清皮質酮的含量以及升高海馬BDNF的含量，產生抗抑郁樣的作用。