腸潤方對功能性便秘大鼠結腸Cajal間質細胞及c-kit/SCF信號通路的影響※

●肖秋平 洪燕秋 耿學斯▲ 文 磊

功能性便秘（function constipation，FC）是消化系統常見病、難治病，全球發病率逐漸上升。FC的發生與多種因素相關，但發病機制尚未完全闡明。研究顯示，伴有結腸動力障礙的FC患者占相當比例[1]。目前普遍認為Cajal 間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）的異常是導致胃腸道動力障礙性疾病的一個重要原因，ICC 特異性表達的酪氨酸蛋白激酶生長因子受體（Tyrosine kinase growth factor receptor，c-kit）及其配體干細胞因子（stem cell factor，SCF）結合所啟動的信號通路對ICC 生長發育及功能的維持至關重要。中醫認為便秘的反復發生主要由于陰血不足，腸道失潤，或氣虛氣滯，推動無力，或兩者兼并。基于“運脾滋陰”治法的腸潤方在前期臨床研究中取得確切療效[2-3]。本研究旨在探討腸潤方對FC 大鼠結腸ICC 及c-kit/SCF信號系統的影響，揭示滋陰行氣法治療FC、改善結腸動力的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 動物健康SD大鼠72只，雌雄各半，體重（220±20）g，由廈門大學實驗動物中心采購提供，許可證號：SYXK(閩)2013-0006。飼料、墊料來源同上，飼養室溫度20℃～25℃，濕度45%～55%。

1.2 藥物與試劑腸潤方（炒白術20g，玄參15g，麥冬15g，火麻仁15g，枳實15g，檳榔15g），腸潤方水煎劑：將95g 生藥飲片浸泡于蒸餾水中（蒸餾水略沒過飲片即可）1h后回流煮沸30min，濾出藥液，再加入蒸餾水（蒸餾水略沒過飲片即可），同法煮沸30min，過濾。將兩次得到的濾液混合，在3500rpm 離心濾液10min，藥液旋蒸濃縮至47.5mL，得到200%腸潤方水煎液。實驗前配制含生藥量分別為0.5g/ml、1g/ml 和2g/ml的腸潤方水煎液。

麻仁丸：福州海王金象中藥制藥有限公司（批號：1805042）；復方地芬諾酯：新鄉市常樂制藥有限公司（批號：17040952）；PBS 磷酸緩沖液（索萊寶公司，批號：P1010）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，批號：P0010S）；PVDF 膜（邁博瑞公司，批號：R7EA3809G）；c-kit 抗體（Thermo Fisher 公司，批號：34-8800）；SCF 抗體（Abcama 公司，批號：ab64677）；IgG抗體（Abcama公司，批號：ab150077），RNA提取試劑盒（Promega 公司，批號：LS1040）；逆轉錄試劑盒（Promega 公司，批號：A5001）；RT-PCR 試劑（全式金公司，批號：AQ101-03）；免疫組化染色試劑盒（索萊寶公司，批號：SP0041）。

1.3 分組與造模72 只健康SD 大鼠正常喂養和觀察1周，隨機分為空白組、模型組、麻仁丸組以及腸潤方高、中、低劑量組，共6 組，每組12 只。根據課題組前期實驗造模方法造模[4]，空白組予蒸餾水2.2 ml/次，2次/天灌胃，模型組、麻仁丸組、腸潤方組予復方地芬諾脂10mg/kg/d 灌胃，連續灌胃14 天。各組均于末次給藥30min 后以0.2mL/20g 的墨汁灌胃，記錄大鼠首粒黑便排出時間、6h 內的排便粒數和大便性狀，通過SPSS 22.0 統計軟件進行分析，驗證便秘模型成功制備。

1.4 藥物干預造模成功后，空白組、模型組均予蒸餾水1ml/100g/天，2 次/天灌胃；麻仁丸組予規格為0.6g/粒的麻仁丸按成人（60kg）日服計量2.4g 換算成SD大鼠劑量0.3g/kg/d，2次/d灌胃；腸潤方高、中、低劑量組根據《中藥藥理實驗方法學》計算出中藥人鼠等效劑量，按成人（60kg）日服劑量95g換算成SD大鼠服用劑量為低劑量組5.5g/kg/d，中劑量組11g/kg/d，高劑量組22g/kg/d，2次/d灌胃，各組連續灌胃14天后進行取材。

1.5 標本采集末次給藥結束后，禁食不禁水12h，頸椎脫臼處死動物，打開大鼠腹腔取2cm結腸腸管共2份，1份經生理鹽水清洗后用OTC保鮮劑固定，液氮保存待western blot 及RT-PCR 測定，1 份固定于中性福爾馬林中，以待免疫組化測定。

1.6 免疫組織化學法檢測取放于4%多聚甲醛固定的組織，經脫水、包埋制成連續切片。石蠟切片脫蠟后進行抗原修復。用組化筆畫圈圍住組織，滴加3%過氧化氫滅活內源酶活性。加山羊血清封閉液封閉非特異性位點，室溫10min。甩掉封閉液，圈內滴加一抗（1:1000稀釋的兔抗鼠c-kit或1:1000稀釋的兔抗鼠SCF）蓋住組織，放入濕盒內4℃過夜。二抗（1:3000稀釋的羊抗兔IgG）室溫孵育10min。鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液在室溫下孵育10min，DAB 顯色。蘇木素復染細胞核，自來水沖洗反藍，1%鹽酸酒精分化3秒，自來水沖洗三分鐘，脫水，中性樹膠封片。用Definiens Tissue StudioTM 圖象分析系統，測定各組ckit、SCF 陽性細胞的平均光密度值(average optical den-sity，AOD)。

1.7 Western Blot 檢測取大鼠結腸組織樣品，加入蛋白裂解液混勻，冰上靜置10～15min，12000rpm離心10min，取上清液，重復離心，BCA 蛋白測定試劑盒測得待測樣品的蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，轉膜，PVDF膜取出置于含5%奶粉的TBST中，室溫慢搖封閉1h，一抗（1:1000 稀釋的兔抗鼠c-kit 或1:1000稀釋的兔抗鼠SCF）放置低速搖床上4℃過夜。TBST漂洗3次，10min/次，室溫孵育辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（1:3000 稀釋的羊抗兔IgG）低速孵育1h，TBST漂洗3次，10min/次。ECL工作液浸潤PVDF膜，避光顯影，Tubulin作為內參照。

1.8 RT-PCR 檢測取液氮凍存新鮮結腸組織，提取總RNA，測定RNA 濃度，RNA 電泳測定其完整性。經promega 反轉錄試劑盒操作，所得cDNA 進行RTPCR 檢測。反應體系共10μL。經ABI Primer Express10 軟件設計熒光定量PCR 引物，由大連寶生物工程有限公司合成。各檢測指標引物序列見表1。熱循環參數如下：95℃30s 為第一階段，1 個循環；95℃5s，60℃30s 為第二階段，45 個循環。以β-actin基因為內參照。CFX96Manager軟件分析結果。

表1 c-kit、SCF、β-actin引物序列

1.9 統計學方法數據采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理。數據以均數±標準差（）表示，組間比較若滿足正態性且方差齊時采用單因素方差分析LSD法和SNK法，若方差不齊，采用DunnettT3法進行方差檢驗和兩兩比較，若數據非正態分布采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 便秘模型建立情況實驗過程中，無大鼠死亡，表明復方地芬諾酯法制備FC 模型具有安全性、穩定性。模型組、麻仁丸組及腸潤方高中低各劑量組在大鼠首粒黑便排出時間、6h內糞便排出顆粒數量以及糞便重量與空白組比較均有統計學差異（P＜0.05），表明FC大鼠模型成功復制。見表2。

表2 6組大鼠排便情況比較（）

表2 6組大鼠排便情況比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05

2.2 免疫組化檢測大鼠結腸組織中c-kit、SCF 的分布與表達c-kit、SCF均分布于結腸組織和間隙。從c-kit的表達情況分析，結果顯示：與空白組比較，模型組和腸潤方低劑量組的c-kit表達量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），腸潤方高劑量組和中劑量組與空白組比較無顯著差異（P＞0.05），而麻仁丸組的c-kit表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻仁丸組、腸潤方高劑量組和中劑量組的c-kit 表達量均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），而腸潤方低劑量組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。其中，腸潤方高、中、低劑量組的c-kit表達量呈逐漸下降的趨勢。見圖1。

圖1 免疫組化檢測各組大鼠結腸中c-kit分布與表達情況（SP×400）

從SCF 的表達情況分析，結果顯示：與空白組比較，模型組和腸潤方中劑量組和低劑量組的SCF表達量均顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），而麻仁丸組和腸潤方高劑量組與空白組比較無顯著差異（P＞0.05）；與模型組比較，麻仁丸組、腸潤方高劑量組和中劑量組的SCF表達量均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），而腸潤方低劑量組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。其中，腸潤方高、中、低劑量組的SCF表達量呈逐漸下降的趨勢。見圖2。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠結腸中SCF分布與表達情況（SP×400）

2.3 Western Blot 檢測各組大鼠結腸組織中c-kit、SCF蛋白的表達與空白組比，模型組、麻仁丸組、腸潤方低劑量組c-kit 表達顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），中、高劑量組無顯著差異（P＞0.05）；與模型組比，麻仁丸組及腸潤方高、中劑量組c-kit表達顯著升高（P＜0.001），腸潤方低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。見圖3A、3B。

與空白組比，模型組、麻仁丸組、腸潤方中、低劑量組SCF 表達顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），高劑量組無顯著差異（P＞0.05）；與模型組比，麻仁丸組、腸潤方高、中劑量組SCF 表達顯著升高（P＜0.001），低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。見圖3A、3C。

圖3 western blot檢測大鼠結腸組織c-kit、SCF的蛋白水平

2.4 RT-PCR 檢測各組大鼠結腸組織中c-kit、SCF mRNA的表達與空白組比，模型組、麻仁丸組、腸潤方中、低劑量組c-kit mRNA 表達顯著降低（P＜0.001或P＜0.01 或P＜0.05），高劑量組無明顯差異（P＞0.05）；與模型組相比，麻仁丸組、腸潤方高劑量組、中劑量組中c-kit 表達顯著升高（P＜0.001 或P＜0.05），低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。見圖4。

與空白組相比，模型組、麻仁丸組、腸潤方低劑量組中SCF mRNA 表達均顯著降低（P＜0.001 或P＜0.01），高、中劑量組無明顯差異（P＞0.05）；與模型組相比，麻仁丸組、腸潤方高、中、低劑量組均顯著升高（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）。見圖4。

圖4 RT-PCR檢測大鼠結腸組織c-kit、SCF mRNA表達水平

3 討論

腸道平滑肌與心臟相同，也表現其自主的電節律性，它起源于肌間神經叢周圍的起搏細胞，稱為Cajal間質細胞。ICC通過自發產生的節律性慢波控制腸道收縮的節點、頻次與方向，慢波由腸神經-ICC-平滑肌細胞網絡間的縫隙連接傳播，最終引發平滑肌的周期收縮[5]。ICC介導胃腸道肌電活動的起搏，同時也是腸內神經元向胃腸道平滑肌細胞傳遞信號的必要條件[6]，因此它被認為對胃腸運動的調控至關重要。ICC的缺失和功能受損直接影響了胃腸道的正常運動，可引起便秘、糖尿病胃輕癱、功能性消化不良等胃腸動力障礙性疾病。在FC患者中相當一部分人表現為結腸排空遲緩，而結腸動力減弱是造成這些患者排空遲緩的原因。充分的證據顯示[7-9]，FC的發生與ICC的改變密切相關。研究表明[10-11]，慢傳輸型便秘（STC）患者結腸組織中ICC 數量與體積較正常人明顯降低。一項對20例重度便秘患者結腸次全切除術的病理研究顯示，有60%的患者出現ICC 發育不全[12]。本研究采用復方地芬諾脂制備FC 大鼠腸動力障礙模型，通過免疫組化法對大鼠結腸組織進行觀察，模型組c-kit、SCF 的表達明顯降低，證實ICC 參與了FC 的發病機制。

在ICC 的發育、分化及表型的維持中c-kit、SCF及其組成的c-kit/SCF 信號通路扮演了重要的角色。c-kit 是由人染色體4q11～12 的原癌基因c-kit 編碼的跨膜蛋白，由于其特異性表達于ICC，ICC可以通過標記c-kit抗體來識別。c-kit在胞外配體結合區與神經元表達的配體干細胞因子SCF 結合，SCF 發生二聚化后c-kit單體結構發生改變，產生均聚，導致細胞膜上氨基殘基的自動磷酸化，啟動SCF/c-kit 信號通路，介導各種第二信號分子調節ICC的細胞功能[13]。研究表明[14]，ICC與平滑肌細胞都來源于Kit陽性的前體細胞群，接受Kit 信號轉導的Kit 陽性前體細胞保留Kit 的表達并發展為功能性ICC，而未經該途徑轉導的Kit陽性前體細胞則成為平滑肌細胞，提示Kit信號在對ICC種群的發育和維持至關重要。Tong W等[15]研究發現，對小鼠注射抗c-kit 單克隆抗體阻斷c-kit 后，小鼠腸內ICC 幾乎消失，監測電節律變化顯示慢波活動丟失，局部應用SCF后發現經c-kit信號阻斷的ICC數量和空腸電節律恢復，提示SCF激活的c-kit信號通路是調控ICC存活和增殖的關鍵途徑。在本研究中，與空白組相比，模型組c-kit、SCF 在結腸組織的表達明顯降低，c-kit、SCF 蛋白及其基因表達水平下降。免疫組化結果顯示c-kit、SCF的表達與腸潤方劑量呈正相關，經腸潤方（高、中劑量組）治療，大鼠結腸組織ckit、SCF 蛋白及c-kit mRNA、SCF mRNA 表達明顯升高，說明FC 的發生及ICC 的改變與c-kit、SCF 表達異常、c-kit/SCF 信號通路受阻相關，實驗進一步表明腸潤方治療FC是通過介導c-kit、SCF mRNA 的表達，提高c-kit、SCF 蛋白的表達，從而修復c-kit/SCF 信號通路，提高ICC的數量和功能，促使ICC恢復對胃腸道節律的正常調控。

中醫認為正虛邪戀，纏綿不愈，正氣不足是導致慢性便秘的根本原因。FC 病機在于陰血不足，腸道失潤，亦或是氣虛氣滯，推動無力，或兩者兼有。治療便秘時不應局限于通便，而應從患者自身整體狀況出發，發揮中醫整體把握、病癥兼顧、平衡陰陽及調和氣血的優勢，改善便秘癥狀的同時減少其并發癥，從而提高患者生存質量。基于上述認識，筆者提出“以補通秘”的治療原則，其目的是通便不用瀉藥，通過健脾行氣、滋陰潤腸，促進腸道蠕動而達到標本兼治。腸潤方是以“滋陰行氣”為基本治法，具有滋陰益氣、行氣潤腸的功效。腸潤方治療FC 臨床療效顯著，有效提高患者生存質量，近期有效率達90.0%，隨訪3個月有效率67.5%[2-3]。方中君藥白術甘溫補虛，歸脾、胃經，既可補氣又兼健脾，脾氣健運則胃得以行其津液，胃腸分泌旺盛，蠕動增強，津行腸潤而運腸，則腸枯便停之勢得緩。玄參苦、咸、微寒，壯水之主，啟腎水而能治腸燥舟停之液干；麥冬甘、寒，益陰生津，在《藥品化義》尚有“治虛人元氣不運，胸腹虛氣痞滿”的補氣之說，玄參、麥冬配伍，增液益氣而水流舟行，與方中其他藥物相伍，瀉而不峻，潤而不膩，二者共為臣藥。火麻仁甘、平，歸脾、胃、大腸經，質潤多脂，滋陰養血，潤腸通便，善于治療津血虧虛之腸燥便秘；枳實苦、辛、微寒，具有行氣導滯，通導腸腑積滯的功效；檳榔辛溫，行氣布津，歸胃與大腸二經，與方中諸味滋陰藥物配伍開辛潤之用，三者共為臣使之藥。火麻仁配伍白術可益氣養陰潤腸；枳實配伍白術，取枳術丸之意，益氣行津濡潤腸道，起到消補兼施的作用；檳榔破氣消積，配伍枳實，行胃腸之積滯通調腸道。諸藥相合，共奏健脾行氣、滋陰潤腸之功，具有補重于消，寓消于補，以補為通的特點。

本研究表明，腸潤方可明顯提高c-kit、SCF 蛋白表達及c-kit、SCF mRNA 的表達水平，通過修復c-kit/SCF 信號系統恢復ICC 對胃腸道電節律的正常調控，達到促進腸道蠕動，恢復胃腸道動力的作用。前期研究表明[4]，腸潤方亦可通過激活P38MAPK信號通路調控AQP3、AQP9 的表達，起到促進黏膜分泌黏液潤滑腸道作用。腸潤方治療便秘具有多靶點的優勢，通過整體調控而達到行氣潤腸的效果，進一步闡明基于滋陰行氣法的中醫藥治療FC的現代醫學機制。