黑胸散白蟻腸道內芽孢桿菌F8產纖維素酶發酵工藝研究

馮 沖,李婼雯,夏 雪, 頓弘斌,田嘉興

(鄭州工程技術學院 化工食品學院，河南 鄭州 450044)

纖維素酶在食品、飼料、紡織、醫藥、造紙及洗滌劑等行業[1]有廣泛應用價值，但酶用量大、成本高,在一程度上限制了其生產應用。纖維素酶在自然界的分布非常廣泛，存在于微生物、某些脊椎動物，甚至是高等植物體內[2]。自然界中纖維素類物質的生物降解主要依賴于產纖維素酶的微生物來完成[3]，能產生纖維素酶的微生物主要有細菌、真菌、放線菌等。纖維素酶產生菌的自然篩選是從自然界中獲得野生菌株，是菌株選育工作的最原始、最基礎的方法[4-5]，也是構建菌種數據庫的有效方法。本文從黑胸散白蟻腸道內篩選出來一株產纖維素酶的芽孢桿菌，命名為F8[6]，對其產酶發酵工藝和發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌F8菌株：來自河南農業大學農業農村部農業微生物酶工程重點實驗室；種子液培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，蒸餾水1000 mL，調pH至7.0，121℃滅菌20 min；發酵產酶培養基：蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，稻草秸稈粉0.5%，蒸餾水1000 mL。121℃滅菌20 min。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液 (pH=4.8)：0.1 M醋酸溶液和0.1 M醋酸鈉溶液以46的體積比混合，低溫冷藏備用；DNS染色試劑[7]：溶液A(分析純NaOH 104 g，溶于1300 mL水中，加入30g分析純3，5-二硝基水楊酸)和溶液B(分析純酒石酸鉀鈉910 g，溶于2500 mL水中，加入25 g無水亞硫酸鈉)混合后加入1200 mL水，暗處放置一星期后使用。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的制作

分別吸取1 mg/mL標準葡萄糖液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，依次放入15 mL比色管中，補加水至2.0 mL，加入2.0 mL DNS試劑，具塞，沸水浴中反應10 min，冷卻后定容至15 mL。分光光度計550 nm波長下測OD值，3次重復試驗的均值用最小二乘法擬合y=ax+b一元線性方程，由光密度值引得葡萄糖量。

FPA和CMC酶活的測定參照文獻[8-9]進行。

1.2.3 粗酶的提取

取發酵液1.5 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得粗酶液。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線如圖1，回歸方程為y=1.8219x-0.053，標準曲線的線性相關系數R2=0.9994。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

2.2 最佳碳源的確定

初始培養基分別以0.5%(質量百分比)玉米秸稈、稻草、微晶纖維素、麩皮、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、可溶性淀粉作為碳源。接種量5%，初始pH7.5，35℃，150 r/min發酵產酶培養2 d ，測定發酵粗酶液的CMC酶活和FPA。結果顯示篩選菌株F8對碳源的利用比較廣泛，其中以CMC-Na為碳源時酶活力最高，CMC酶活和FPA分別是為0.032 U/mL,0.048 U/mL。因此，確定CMC-Na為最佳碳源。

2.3 最佳氮源的確定

以CMC-Na為主碳源，分別以1%(質量百分比)蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，豆粕粉，稻草，尿素，(NH4)2SO4, (NH4)2HPO4，1%蛋白胨+1%酵母粉為氮源，接種量5%，初始pH7.5，35℃，150 r/min發酵產酶培養2 d ，測定發酵粗酶液的CMC酶活和FPA。結果顯示菌株F8對氮源的利用也很廣泛，尤其以牛肉膏為氮源時FPA最高，為0.039 U/mL(此時CMC酶活為0.028 U/mL)；以豆粕為氮源時CMC酶活最高，為0.031 U/mL(此時FPA為0.031 U/mL)。可以看出，CMC酶活與FPA的相對最高值不能在同一氮源條件下取得。由于豆粕的成本較低，綜合考慮以豆粕為最佳氮源。

2.4 最佳接種量的確定

分別以2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%及20%的接種量，將種子培養液接種于100mL產酶培養液中，初始pH7.5，36 ℃，150 r/min條件下振蕩培養2 d，測定各接種量條件下粗酶液的CMC酶活和FPA，結果如圖2所示。

圖2 接種量對菌株產酶能力的影響

由圖2可知，當接種量為6%左右時，CMC酶活與FPA都相對較高，分別達0.0162 U/mL和0.0245 U/mL。因此，確定6%為最佳接種量。

2.5 最佳裝液量的確定

在300 mL三角瓶中分別裝入40，60，80，100，120，140，160，180及200 mL發酵產酶培養基，接種量6%，初始pH7.5，36 ℃，150 r/min條件下培養2 d，測定各條件下粗酶液的CMC酶活和FPA，結果如圖3所示。

國務院總理周恩來1974年做出批示：“天然氣進京，把首都變成空氣最干凈，街道最清潔，環境最優美的城市。”把華北油田的天然氣引進北京城，這是周總理生前愿望，也是廣大石油工人的多年夙愿。

圖3 裝液量對菌株產酶能力的影響

由圖3可知，裝液量在60 mL時，CMC酶活與FPA都相對較高，分別為0.0164 U/mL和0.0208 U/mL。說明充足的氧氣有利于提高菌體的酶活，其中60 mL裝液量為最佳。

2.6 最佳pH的確定

按6%的接種量，將種子培養液接種于60 mL產酶發酵液中，初始發酵液的pH分別調至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。36 ℃，150 r/min條件下振蕩培養2 d，使菌株發酵產酶，測定各pH時粗酶液的CMC酶活與FPA，結果如圖4所示。

圖4 pH對菌株產酶能力的影響

由圖4可知，發酵液初始pH的變化對F8產酶活力的影響較大。pH為7.0時，CMC酶活與FPA都達最高值，分別為0.0254 U/mL和0.0183 U/mL。因此，選擇pH 7.0為最佳發酵初始pH。

2.7 最佳溫度的確定

按6%的接種量，將種子培養液接種于初始pH 7.0的60 mL產酶發酵液中，分別放入25，28，32，36，40℃的搖床中，150 r/min條件下振蕩培養2 d，使菌株發酵產酶，測定各pH時粗酶液的CMC酶活與FPA，結果如圖5所示。

圖5 溫度對菌株產酶能力的影響

由圖5可知，培養溫度對F8產纖維素酶影響較大。隨著溫度的上升，發酵液中酶活力也隨之增加，在發酵培養溫度為36℃時，菌株產CMC酶活與FPA均為最大值，分別是0.0213 U/mL和0.0224 U/mL，此后溫度繼續升高，酶活力反而下降。因此，36℃是發酵產纖維素酶的最佳培養溫度。

2.8 最佳時間的確定

按6%的接種量，將種子培養液接種于初始pH 7.0的60 mL產酶發酵液中，放入36℃的搖床中，150 r/min條件下分別培養1～5 d，使菌株發酵產酶，分別測定不同培養時間粗酶液的CMC酶活與FPA，結果如圖6所示。

圖6 時間對菌株產酶能力的影響

由圖6可知，隨著培養時間的延長，F8菌株產酶活力也隨之增大，并在2 d處CMC酶活與FPA都取得最高值，分別為0.0186 U/mL和0.0229 U/mL。因此，最佳時間確定為2 d。

2.9 正交試驗設計

為研究篩選菌株F8產纖維素酶的最佳培養條件，設計正交試驗驗證各影響因素，對各個培養條件進行綜合分析和優化。根據上述單因素的試驗結果，選擇七因子三水平進行正交試驗，如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

由表2進行直觀分析，可以看出，CMC酶活的最優組合是A2B3C1D2E1F3G1，比較各因素的極差大小為RB=RG>RA=RE>RC>RD=RF，對CMC酶活影響的主次順序為BGAECDF；FPA的最優組合是A1B2C1D2E2F2G2，比較各因素的極差大小為RD>RA=RF=RG>RC=RE>RB，對FPA影響的主次順序為DAFGCEB。由于兩個指標單獨分析出來的最優條件不一致，需要根據因素對兩個指標影響的主次順序綜合考慮確定出最優組合。

綜合直觀分析，本試驗的最優組合是A1B3C1D2E1F2G1。碳源CMC-Na濃度是0.5%，氮源濃度1.5%，裝液量40 mL，pH7.0，接種量5%，溫度35 ℃，時間2 d。

表2 正交試驗結果

續表2

3 結論

從黑胸散白蟻腸道內篩選出來的一株產纖維素酶的芽孢桿菌F8，對其產酶發酵工藝條件進行優化。該菌株產纖維素酶的最佳條件為：羧甲基纖維素鈉質量百分比為0.5%，氮源質量百分比為 1.5%，裝液量40 mL/300mL，初始pH 7.0，接種量5%，溫度35 ℃，時間2 d。