骨髓間充質干細胞對膿毒癥新生大鼠肺損傷的影響及其機制

蘭江麗 梁秋梅 馮繼峰 鄭劍秋

(廣西壯族自治區婦幼保健院麻醉科，南寧市 530000，電子郵箱：70588175@qq.com)

膿毒癥是外界病原微生物感染造成的全身性炎癥反應綜合征，可快速進展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征(multiple-organ dysfunction syndrome，MODS)，其中肺是膿毒癥的主要靶器官[1-3]。新生兒免疫系統發育不完善，極易受到病原微生物感染，易誘發膿毒癥，而膿毒癥易進展為膿毒癥休克和MODS，危及患兒的生命[4]。研究表明，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)具有抗炎、抗凋亡、免疫調節和組織修復等功能[5-6]，能夠顯著抑制膿毒癥肺損傷和MODS的炎癥反應，但具體調節機制尚不清楚。本研究通過建立脂多糖誘導的新生大鼠膿毒癥肺損傷模型，探討BMSC移植對膿毒癥肺損傷炎癥反應的影響及其可能機制，為新生兒膿毒癥肺損傷的治療和干預提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)和杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養基、脂多糖購自美國Sigma-Aldrich 公司(批號：P3288,51435C，SMB00610)；10%特級胎牛血清購自美國HyClone公司(批號：SH30084.03)；白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α 酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(批號：CSB-E08055r、CSB-E04640r、CSB-E11987r)；TRIzol 購自上海碧云天生物技術有限公司(批號：R0016)，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)、PCR TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒均由日本Takara公司生產(批號：RR037A、RR820A)；腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)/p65、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司(批號：13377、14694、8242、5174)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG購自美國Proteintech Group公司(批號：SA00001-2)，電化學發光試劑盒購自碧云天公司(批號：P0018S)。UV-2100PC型紫外可見分光光度計由美國Unico公司生產，Mx3000P實時熒光PCR儀由美國Agilent生物技術有限公司生產，Tans-Blot?Turbo全能型蛋白轉印系統及ChemiDocTMMP全能型成像系統由美國Bio-Rad?生物技術有限公司生產。

1.2 實驗動物 出生1 d的無特定病原體級SD大鼠60只，雌雄不限，體質量20～25 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(粵)-2014-0002。4周齡的無特定病原體級SD大鼠20只，雌雄不限，體重約250 g，均購自廣西醫科大學醫學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(桂)2019-0002，實驗前均在動物飼養室馴養兩周，室溫為(25±1)℃，動物自由進食和飲水，并定時更換墊料。

1.3 BMSC的提取與培養 采用文獻[7]的方法進行BMSC的提取與培養。取4周齡的SD大鼠，采用引頸法處死，75%乙醇浸泡5 min后解剖分離出大鼠的股骨和脛骨，浸泡在含有雙抗的DEME培養基中。用含10%特級胎牛血清的低糖DMEM培養液反復沖洗股骨和脛骨骨髓腔，獲得細胞懸液約4 mL，4℃下1 200 r/min離心5 min后接種于含DEME培養基的細胞培養瓶中，放置于37℃、5% CO2的培養箱進行原代培養。48 h后換液，去除未貼壁細胞，原代細胞貼壁80%～90%后傳代培養。取第4代BMSC用于本實驗。

1.4 膿毒癥模型制備及干預方法 按照隨機數字表法，將新生SD大鼠隨機分為對照組、膿毒癥組和膿毒癥+BMSC處理組(BMSC組)各20只。膿毒癥組和BMSC 組大鼠，經腹腔注射脂多糖(1 mg/kg)構建膿毒癥模型[8]，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。BMSC組在建模后2 h內經腹腔輸注0.5 mL的BMSC (1×105個細胞/只)，其余兩組大鼠輸注等量生理鹽水。建模后24 h處死大鼠，暴露胸腔，經右心室取血，4℃下1 800 r/min 離心15 min后取血清；結扎右肺，用預冷的PBS反復灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(bronochoalveolar lavage fluid,BALF)。-80℃保存血清、BALF和肺組織待檢。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.5 肺組織濕/干比的計算及病理學觀察 取右肺中上葉組織稱取濕重，置60℃烘干箱48 h后稱取干重，計算濕/干比。取右肺下葉組織以10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋切片及蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變并評分。評分內容包括肺泡充血、出血、白細胞滲出到肺泡腔或血管壁和肺泡壁損傷，均按照 0～4分進行評分[9]，其中少量輕微損傷為0分，輕度損傷為1分，中度損傷為2分，重度損傷為3分，嚴重損傷為4分。

1.6 血清及BALF中炎癥因子含量的檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，均按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 肺組織TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA表達的檢測 采用TRIzol法提取左肺上葉組織總RNA，UV-2100PC型紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用實時熒光定量PCR檢測TNFR1、VCAM-1、NF-κB/65 RNA的表達水平，反應體系包括2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4 15 μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 2.0 μL、PCR上游引物(10 μM)2.0 μL、PCR下游引物(10 μM)2.0 μL、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)1.0 μL、cDNA 4.0 μL和RNase Free dH2O 4 μL，總體積為30 μL。反應條件：95℃預變性30 s；90℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環。TNFR1上游引物5′-TGAGACGCATTTCCAGTGTG-3′，下游引物5′-AGAATCCTGCGTGGCAGTTA-3′；VCAM-1上游引物5′-CTACATCCACACTGACGCTGAG-3′，下游引物5′-CAGGGAATGAGTAGACCTCCACTT-3′，NF-κB/p65上游引物5′-GATGGGACGACACCTCTACACATA-3′，下游引物5′-CCCAAGAGTCGTCCAGGTCA-3′；內參GAPDH上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAGACGCCAGTA-3′。引物均由日本TaKaRa公司合成。采用相對定量法2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。

1.8 蛋白質免疫印跡檢測肺組織TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65蛋白表達 采用RIPA和PMSF(按1 mL RIPA/10 μL PMSF/100 mg組織的比例配制)提取左肺下葉組織總蛋白，并采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度后，經變性、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜及封閉(5%脫脂奶粉封閉液，搖床震動下室溫封閉1 h)后，分別以多克隆TNFR1(1 ∶1 000)、VCAM-1(1 ∶1 500)、NF-κB/p65(1 ∶1 000)和GADPH抗體(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜后采用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h。經電化學發光試劑盒顯影及ChemiDocTMMP 全能型成像系統成像后，測定目的蛋白的灰度值，以目的蛋白與GADPH蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學分析 采用SPSS 13.0進行統計學分析。正態分布計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠肺組織濕/干比比較 與對照組比較，膿毒癥組和BMSC組大鼠肺組織濕/干比增加(均P<0.05)；與膿毒癥組比較，BMSC組大鼠肺組織濕/干比降低(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠肺組織濕/干比和病理學評分比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05。

2.2 3組大鼠肺組織病理學改變和評分 對照組大鼠肺組織無明顯病理學改變；膿毒癥組大鼠肺組織結構紊亂，肺間質顯著充血水腫，肺泡內大量炎癥細胞和紅細胞滲出；BMSC組大鼠肺組織結構輕度紊亂，肺間質部分充血水腫，肺泡可見少量炎癥細胞和紅細胞滲出。與對照組比較，膿毒癥組和BMSC組大鼠肺組織病理學評分均增加(均P<0.05)；與膿毒癥組比較，BMSC組大鼠肺組織病理學評分降低(均P<0.05)。見表1和圖1。

對照組 膿毒癥組 BMSC組圖1 光鏡下3組大鼠肺組織病理學改變(蘇木精-伊紅染色，×100)

2.3 3組大鼠血清及BALF中炎癥因子水平比較 對照組、BMSC組、膿毒癥組大鼠血清及BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均依次升高(均P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05。

2.4 3組大鼠肺組織TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA和蛋白表達水平比較 對照組、膿毒癥組、BMSC組肺組織TNFR1蛋白及mRNA相對表達水平依次升高；對照組、BMSC組、膿毒癥組肺組織VCAM-1和NF-κB/p65 蛋白及mRNA相對表達水平依次升高 (均P<0.05)，見表3和圖2。

表3 3組肺組織中TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA和蛋白表達水平比較(x±s)

注： 與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05。

圖2 3組大鼠肺組織中TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65蛋白的表達

3 討 論

本實驗使用脂多糖建立膿毒癥大鼠模型，膿毒癥組大鼠血清及BALF中細胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α表達明顯上調，肺組織水腫并出現明顯的病理學改變，提示新生大鼠的膿毒癥模型建模成功。BMSC是再生醫學中常用的干細胞，具有抑制炎癥、改善凝血功能、調節免疫反應、促進缺血組織和血管再生等生物學效應[10-13]。本實驗探討了BMSC對脂多糖所致膿毒癥新生大鼠肺損傷及炎癥反應的影響。結果顯示，與膿毒癥組比較，BMSC組大鼠的肺組織濕/干比降低(P<0.05)，肺組織病理學改變減輕，提示BMSC能夠促進新生大鼠膿毒癥肺損傷的修復；同時，BMSC組大鼠的細胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α水平低于膿毒癥組(P<0.05)，提示BMSC可抑制炎癥細胞因子IL-1β、IL-6與TNF-α的釋放，調節機體促炎與抗炎反應的平衡，從而促進肺損傷的修復。

TNFR1是由單核細胞分泌的蛋白水解蛋白，其胞外結構域可識別TNF-α并與之結合[14]。有學者應用TNF-α或脂多糖上調人間充質干細胞的可溶性TNFR1表達后，發現TNF-α的生物學效應被抑制，提示TNFR1是TNF-α的負反饋機制之一[15]。Yagi等[16]研究發現，BMSC通過激活并釋放可溶性TNFR1而抑制脂多糖引起的過度炎癥反應和多個靶器官蛋白水解損傷。本研究中，與對照組大鼠相比，膿毒癥組大鼠接受LPS刺激后TNFR1表達上調，但未達到抑制炎癥因子釋放的水平；與膿毒癥大鼠比較，BMSC處理后膿毒癥新生大鼠肺組織的TNFR1表達上調，而血清及BALF中TNF-α水平降低(P<0.05)，提示BMSC治療新生大鼠膿毒癥肺損傷的機制可能是通過上調TNFR1表達而抑制TNF-α等炎癥因子釋放。

VCAM-1是表達在內皮細胞、平滑肌細胞和骨髓基質細胞等細胞表面的糖蛋白，水解后形成具有生物活性的片段即可溶性VCAM-1[17]。研究表明，TNF-α可刺激免疫活性細胞分泌IL-1β和IL-6等炎癥因子，誘導血管內皮細胞表達VCAM-1，促進白細胞黏附在血管內皮而引起血管內皮損傷[18-19]。王春苗等[20]發現，TNF-α預處理可明顯提高BMSC的VCAM-1表達及遷移黏附能力，將TNF-α預處理的BMSC移植于心肌梗死模型大鼠后，大鼠左心室功能增加而梗死心肌細胞的膠原沉積。本研究的結果顯示，BMSC組大鼠肺組織VCAM-1 mRNA和蛋白均較膿毒癥組大鼠降低(P<0.05)，提示BMSC或可通過抑制白細胞黏附在血管內皮而減輕血管內皮損傷。

NF-κB/p65介導的信號通路如Toll樣受體、蛋白激酶B/腺苷酸激活蛋白激酶參與膿毒癥肺損傷炎癥反應的調控[21-23]。Yagi等[16]研究發現，在炎癥因子刺激激活的上皮細胞中，BMSC可抑制其NF-κB的激活。本研究結果顯示，BMSC移植后膿毒癥新生大鼠肺組織NF-κB/p65表達較膿毒癥新生大鼠降低(P<0.05)。因此，BMSC減輕脂多糖肺損傷及炎癥反應的機制可能與NF-κB/p65表達受抑制有關。

綜上所述，BMSC可有效減輕新生大鼠膿毒癥肺損傷及炎癥反應，從而促進損傷肺組織的修復，改善器官功能。BMSC減輕新生大鼠膿毒癥肺損傷的機制可能有以下幾點：(1)上調TNFR1表達而抑制TNF-α等炎癥因子釋放；(2)降低VCAM-1表達，抑制白細胞的遷移和黏附；(3)降低NF-κB/p65的表達，抑制炎癥信號通路的傳導。本研究結果或可為臨床上新生兒膿毒癥肺損傷的治療提供實驗參考依據。