非小細胞肺癌患者血清外泌體中表皮生長因子受體的表達情況及其對NCI-H1299細胞增殖和侵襲的影響▲

路 通 鄒志田 裴艷志 喬 峰 朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫院胸外科，黑龍江省佳木斯市 154002，電子郵箱：jnlutong0227@163.com)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是發病率和致死率較高的呼吸系統惡性腫瘤，大部分NSCLC患者確診時已處于中晚期，常伴有遠處轉移，5年生存率極低[1-3]。近年來研究證實，外泌體中的非編碼RNA或蛋白可通過調控腫瘤細胞的惡性生物學行為，進而介導腫瘤的發生發展[4-5]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在多種惡性腫瘤組織和細胞系中異常高表達，包括乳腺癌[6]、胃癌[7]、結直腸癌[8]、肺癌[9]和肝癌[10]等。Zhang等[11]研究發現，胃癌細胞外泌體中EGFR呈高表達，且胃癌細胞外泌體中EGFR過表達可促進腫瘤細胞的增殖和轉移。因此，本研究探討血清外泌體EGFR與NSCLC發生和發展的相關性。

1 材料與方法

1.1 組織標本及血標本來源 收集2012年1月至2017年12月就診于佳木斯大學附屬第一醫院的10例NSCLC患者術前的血清標本(NSCLC組)，患者確診后均未行任何治療，其中男性6例，女性4例，年齡(62.62±8.92)歲；并收集15例NSCLC患者(含上述已收集血清標本的10例患者)手術切除的癌組織和距離癌組織3 cm的癌旁組織。所有NSCLC患者均經影像學和病理學資料證實為原發NSCLC。排除標準：(1)入院前已經進行放療或化療的患者；(2)不同意參與本研究的患者；(3)不能耐受手術的患者；(4)合并有免疫系統疾病的患者。并收集同期8例健康體檢者的血清標本(正常組)，研究對象均無NSCLC及其他疾病，其中男性4例，女性4例，年齡(60.52±9.06)歲。NSCLC組和正常組研究對象的年齡、性別差異均無統計學意義(均P>0.05)。所有研究對象對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經佳木斯大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；批號：01-055-9A)和胎牛血清(批號：04-011-1A)購自美國Biological Industries公司；青霉素和鏈霉素混合液購自北京雷根生物技術有限公司(批號：CA0075)；細胞計數檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(批號：CSB-E08986h)；Transwell小室購自美國康寧公司(批號：CLS3396)；TRIzol試劑盒(批號：9108)和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(批號：RR037A)購自日本TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒(批號：1632086)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)快速制備試劑盒(批號：1610306)購自美國Bio-Rad公司；免疫印跡一抗[抗EGFR抗體(批號：4267)、抗CD63抗體(批號：40623S)、抗CD9抗體(批號：13403)、抗白蛋白抗體(批號：4929)和抗鈣連蛋白抗體(批號：2433)]和二抗[羊抗兔IgG(H+L)，批號：14709)]均購于購自美國CST公司；反轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司(批號：QP007)。

1.3 細胞培養 NSCLC細胞NCI-H1299購自北納生物(貨號：BNCC100268)，采用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中常規培養。

1.4 血清外泌體的分離 取1 mL血清標本和9 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)混合于10 mL離心管中，于4℃、3 653 r/min離心10 min(留取外周血單個核細胞)，再經0.45 μM無菌濾膜過濾到10 mL的超濾離心管后，再經3 653 r/min離心20 min去除結晶、細胞和細胞碎片；隨后小心地將上清液轉移到超速離心管中，于14 704 r/min離心40 min去除大囊泡；留取上清液，于4℃、44 519 r/min離心2 h，留取上清液作為無外泌體血漿，再使用9 mL PBS重懸外泌體，并采用0.22 μm濾膜過濾并轉移到干凈的超速離心管中，然后于4℃、44 519 r/min再次離心1 h，棄上清液；將所獲得的沉淀(即為外泌體)用500 μL PBS重懸，置于1.5 mL EP管內，置于-80℃冰箱備用。

1.5 血清外泌體的鑒定 (1)參考文獻[12]的方法，將分離獲得的新鮮外泌體溶液20 μL，采用20 μL PBS稀釋后滴加到銅網上，室溫干燥15 min。PBS清洗銅網3次，加入1%戊二醛固定5 min；蒸餾水沖洗后采用0.4%醋酸雙氧鈾染色5 min；采用甲基纖維素和醋酸雙氧鈾的混合物再次染色并包被外泌體樣品10 min，室溫晾干10 min后采用Tecnai G2 Spirit TWIN透射電鏡(美國FEI公司)觀察并拍照。(2)采用免疫印跡試驗檢測外泌體標志蛋白(CD9或CD63)、鈣連蛋白和白蛋白。

1.6 相關指標的檢測方法

1.6.1 免疫印跡試驗：取分離獲得的新鮮外泌體20 μL，加入10 μL蛋白裂解液(美國賽默飛世爾公司，批號：89900)于冰上裂解30 min，于4℃、13 423 r/min離心15 min，收集上清。采用二喹啉甲酸法檢測樣本中蛋白總濃度，計算上樣濃度。經SDS-PAGE后轉聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，清洗后加入一抗[EGFR(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)、白蛋白(1 ∶1 000)和鈣連蛋白(1 ∶1 000)]，4℃孵育10 h后加入二抗(1 ∶500)雜交。化學發光儀(美國Bio-Rad公司，型號：170-8265)成像，并用Image J軟件對蛋白條帶進行定量。同法檢測無外泌體血漿及外周血單個核細胞中的相關蛋白。

1.6.2 實時定量PCR檢測NSCLC組織和癌旁組織EGFR mRNA表達水平：采用TRIzol試劑盒提取組織中的總RNA，首先將RNA反轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。PCR反應體系包括10×擴增緩沖液 10 μL，4種dNTP混合物各200 μmol/L，引物各10～100 pmol，模板DNA 0.1～2 μg，Taq DNA聚合酶2.5 U，鎂離子1.5 mmol/L，加三蒸水至100 μL。擴增反應為95℃ 5 min預變性；95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參，采用2-ΔΔCt法計算EGFR mRNA的相對表達水平。所使用引物序列見下表1。

表1 PCR引物序列

1.6.3 CCK-8法檢測NCI-H1299細胞增殖情況：將對數生長期的NCI-H1299細胞接種于96孔板中，密度為1×104個/mL。分為NSCLC組、正常組、對照組，每組設置5個復孔。待細胞完全貼壁后，采用PBS清洗，并加入100 μL DMEM培養液，然后NSCLC組、正常組分別加入10 μL NSCLC患者血清外泌體懸液或正常健康人外泌體懸液，對照組加入等體積的PBS。分別培養24 h、48 h、72 h、96 h，并于相應時間點分別加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h，用酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號：ELX800)檢測450 nm處吸光值。每組樣品做3次重復。

1.6.4 Transwell法檢測NCI-H1299細胞侵襲能力：將對數期NCI-H1299細胞分為NSCLC組、正常組和對照組，用胰酶消化處理后，接種于Transwell小室24孔板內，上室加100 μL(細胞密度為2×105個/mL)細胞懸液，下室加500 μL含10%胎牛血清的培養基，隨后NSCLC組、正常組分別在上室中加入100 μL無血清的DMEM培養基重懸的NSCLC患者血清外泌體懸液、正常健康人外泌體懸液，對照組加入等體積的無血清DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后取出小室，棉簽擦去微孔膜上室的細胞，PBS沖洗小室上下面各兩遍，4%的多聚甲醛固定侵襲并黏附到小室微孔膜下面的細胞15 min，結晶紫染色15 min，PBS沖洗小室，干燥后置于40倍的雙目倒置顯微鏡(上海光學儀器廠，型號：XSP-80A)觀察視野下的細胞數目，以穿膜細胞數評估細胞的侵襲能力。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗。采用Pearson檢驗行相關性分析。將實驗數據統計后采用GraphPad Prism 7進行圖片繪制。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清外泌體的獲取與鑒定 在透射電子顯微鏡下可見，分離得到的血清中外泌體形態呈圓形或橢圓形(圖1)，且血清中多數外泌體粒徑在50～130 nm之間(圖2)。免疫印跡試驗檢測結果顯示，外泌體標志蛋白(CD9和CD63)在“無外泌體血漿”中有輕微條帶，在分離得到的外泌體中高表達；內質網來源的鈣連蛋白未在外泌體中檢出，這說明這些囊泡并非來源于細胞碎片；白蛋白主要在“無外泌體血漿”中大量檢出，同時外泌體標本也有弱條帶(圖3)。以上結果提示，分泌得到的沉淀是血清中的外泌體。

圖1 透射電鏡下血清外泌體的形態圖2 血清外泌體粒徑大小圖3 外泌體相關蛋白的表達情況

2.2 血清外泌體中EGFR蛋白表達情況 NSCLC組血清外泌體中的EGFR蛋白相對表達水平為329 197.52±45 220.35，高于正常組的161 446.82±22 173.33(t=3.331，P=0.040)，見圖4。

圖4 NSCLC患者與健康體檢者血清外泌體中EGFR蛋白的表達水平比較

2.3 NSCLC組織中EGFR mRNA表達水平及其與血

清外泌體中EGFR蛋白表達水平相關性 NSCLC組織中EGFR mRNA相對表達水平為5.66±2.46，高于癌旁組織的3.48±2.22(t=2.550，P=0.008)。Pearson相關性分析顯示，NSCLC患者血清外泌體中的EGFR蛋白相對表達水平與NSCLC組織中的EGFR mRNA相對表達水平呈正相關(r=0.821，P<0.001)。

2.4 3組NCI-H1299細胞增殖情況比較 培養24 h時，3組NCI-H1299細胞增殖活力比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而在培養48 h、72 h、96 h時，NSCLC組NCI-H1299細胞增殖活力高于正常組與對照組(均P<0.05)，而正常組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組NCI-H1299細胞增殖情況的比較(x±s)

注：與正常組、對照組比較，*P<0.05。

2.5 3組NCI-H1299細胞侵襲能力比較 NSCLC組NCI-H1299穿膜細胞數量為(750.21±35.15)個，對照組為(409.52±25.01)個，正常組為(450.04±22.04)個，NSCLC組的NCI-H1299細胞侵襲能力高于對照組和正常組(均P<0.05)，而對照組和正常組的NCI-H1299細胞侵襲能力差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 3組對NCI-H1299細胞侵襲能力比較

3 討 論

隨著醫療水平的提高和科學技術的發展，越來越多的疾病得以治愈，然而目前仍然沒有合理的手段治療腫瘤。NSCLC具有發病率高、預后差、致死率高等特點，目前只有10%～15%的NSCLC患者可在早期確診后5年內存活，因此NSCLC被公認為對健康危害性最高的惡性腫瘤之一[13-14]。由于NSCLC早期癥狀并無特異性，大多數NSCLC患者被確診時已處于中晚期，多伴有遠處轉移。因此，尋找非侵入性且具有高靈敏度、特異性的分子標志物，是NSCLC臨床上迫切需要亟待解決的問題。

外泌體是一種粒徑為40～150 nm的細胞外小囊泡，其含有多種成分，包括遺傳物質、蛋白質和脂質等[15-16]。不同來源的外泌體通過細胞間的傳導、組織間的浸潤以及抗原呈遞等方式，在多種疾病的發展過程中發揮重要作用[17]。作為有效的信號分子，腫瘤細胞來源的外泌體在腫瘤細胞和構成腫瘤微環境的周圍細胞之間發揮作用，腫瘤和間質細胞分泌的外泌體參與了腫瘤進程的各個階段，并在抗腫瘤治療中發揮重要作用[18]。外泌體通過與基底細胞進行物質交換，促進血管的生成和血管表皮生長因子的高表達，從而加速腫瘤的發展[19-20]。因此，外泌體中的蛋白質可作為惡性腫瘤的早期診斷分子標志物[21]。Wang等[22]研究發現，乳腺癌患者血清外泌體中CD82明顯低于健康者，且CD82可作為乳腺癌精準醫學診斷的生物標志物。Kimura等[23]的研究表明，外泌體蛋白CKAP4可作為胰腺癌治療的分子標志物。Pan等[24]的研究證實，來源于NSCLC細胞外泌體中蛋白MUC1高表達，具有作為NSCLC早期診斷的分子標志物。本研究結果顯示，NSCLC患者血清外泌體中的EGFR蛋白表達水平高于正常健康人(P<0.05)，提示EGFR蛋白在NSCLC外泌體中高表達，其或可作為腫瘤早期診斷的標志物。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面蛋白，一旦與表皮生長因子結合可啟動細胞核內的有關基因，從而促進細胞分裂增殖。EGFR高表達可促進腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲、遷移和誘導細胞凋亡，與腫瘤的發生發展、放化療耐受性以及術后預后密切相關[25-26]。靶向抑制EGFR不僅會抑制腫瘤細胞增殖活力，還能夠調節腫瘤微環境，進而抑制腫瘤發展進程[11,27]。張自森等[28]發現，抑制EGFR可明顯下調胃癌AGS細胞惡性生物學行為，從而增強腫瘤細胞對化療的敏感性。林珊等[29]研究證實，EGFR靶向抑制劑聯合放療可顯著抑制NSCLC細胞增殖和促進細胞凋亡，進而增強腫瘤細胞對放療的敏感性。黃邵洪等[30]的研究表明，腫瘤細胞分泌含EGFR外泌體可誘導免疫耐受細胞產生，從而抑制腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞。本研究結果顯示，NSCLC患者血清外泌體中的EGFR蛋白相對表達量與NSCLC組織的EGFR mRNA相對表達量呈正相關(P<0.05)，NSCLC組NCI-H1299細胞增殖活力和侵襲能力明顯高于正常組與對照組(均P<0.05)，說明NSCLC患者血清外泌體中含有的EGFR表達量與腫瘤組織中的表達量具有一致性，且血清中所含EGFR的外泌體可促進NCI-H1299細胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述， NSCLC患者血清外泌體中EGFR蛋白表達水平升高，并與腫瘤組織中的EGFR mRNA表達一致，而且NSCLC患者血清外泌體可促進NCI-H1299細胞增殖和侵襲能力。這或為血清外泌體EGFR用于NSCLC的早期診斷以及預后評估提供理論基礎。