全反式維甲酸對大鼠腎間質纖維化的延緩作用及其可能分子機制▲

周添標 鐘紅珍 鐘志青 謝偉基 翁文娟

(汕頭大學醫學院第二附屬醫院腎內科，廣東省汕頭市 515041，電子郵箱：zhoutb@aliyun.com)

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是導致終末期腎病的共同病理變化，目前其發生機制尚未完全明確，缺乏有效的治療手段及藥物[1]。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的衍生物之一，其在體內通過維甲酸受體(retinoic acid receptor,RAR)發揮作用，目前發現RAR有3種，分別是RARα、RARβ和RARγ[2]。阻抑素是一種抗增殖蛋白，目前發現其具有調控細胞分化及參與細胞線粒體呼吸鏈的作用及功能[3-4]。我們在前期研究中發現，阻抑素參與細胞外基質的積聚和RIF的發病過程，而ATRA可以通過調控阻抑素的表達而發揮抗RIF的作用[5-6]，但具體的作用機制尚不明確。本研究旨在探討ATRA是否可通過RARα調控阻抑素表達，從而發揮延緩RIF進展的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只無特定病原體級雄性SD大鼠，6周齡，體質量120～150 g，購于汕頭大學醫學院實驗動物中心[SCXK(粵)2017-0017]。所有大鼠常規喂養。

1.2 主要試劑及儀器 EliVisionTMplus廣譜檢測試劑盒購自福建邁新生物技術公司(批號：KIT-9902)；RARα、阻抑素、Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ,ColⅣ) 和纖維連接蛋白(fibronectin,FN)抗體均購自美國Abcam公司(批號依次為ab28767、ab75766、ab236640、ab2413)；TRIzolTMLS Reagent試劑盒購自Invitrogen公司(貨號：10296010)；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司(貨號：RR047A)。Vectra成像分析系統購自美國PerkinElmer公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 RIF模型建立及干預方法 采用隨機數字表法將大鼠分為ATRA組﹑RIF模型組和假手術組，每組12只。腹腔注射濃度為30 mL/L的水合氯醛(30 mL/kg)麻醉大鼠后，RIF模型組和ATRA組，在大鼠左背側做長約3 cm左右的切口，然后暴露腎臟，使用棉簽尋找并鈍性分離左側輸尿管，在腎盞和腎下極處采用3-0絲線分別結扎輸尿管，并離斷輸尿管，術畢縫合肌肉及皮膚；假手術組大鼠經水合氯醛麻醉后開腹只探及腎包膜。從術前第1天開始，ATRA組大鼠給予ATRA灌胃[15 mg/(kg·d)]，1次/d，其余兩組大鼠采用等量生理鹽水灌胃，直至處死。分別在造模后第2周末及第4周末，每組各處死6只大鼠，摘取左側腎臟組織分成兩份，其中一份采用100 ml/L的甲醛溶液固定用于病理及免疫組化檢測，另一份于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱中用于mRNA檢測。

1.4 腎臟組織病理檢查 采用常規石蠟包埋方法制作標本，切片厚3 μm，行Masson染色后，顯微鏡下觀察腎臟組織的病理改變情況。隨機選擇腎間質區域20個視野(400倍)，計算RIF指數[7]，RIF指數(%)=(纖維化面積/腎小管間質總面積)×100%。

1.5 檢測腎臟組織中RARα、阻抑素、ColⅣ和FN的蛋白表達 按照EliVisionTMplus廣譜檢測試劑盒說明書，采用免疫組織化學法進行檢測[8]。石蠟切片放置在60℃溫箱中烘烤3 h，采用二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，使用自來水沖洗，磷酸緩沖鹽溶液(0.1 mol/L)沖洗3次，3 min/次；采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)對腎臟組織抗原進行高溫高壓修復10 min，室溫冷卻20 min后，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加3%過氧化氫溶液，常溫孵育10 min以封閉內源性過氧化氫酶，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加兔抗大鼠RARα(1 ∶300)、阻抑素(1 ∶200)、ColⅣ(1 ∶100)及FN(1 ∶100)抗體，4℃孵育過夜，常溫復溫30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3min/次；滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加新鮮配制的二氨基聯苯胺顯色劑；蘇木素復染(約15 s)，0.1%鹽酸酒精分化，后使用磷酸緩沖鹽溶液返藍；自來水沖洗，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。同時用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照。隨機選擇腎間質區域20個視野(400倍)，盡量避開大血管，選擇黃色區域為表達區域，采用Vectra成像分析系統進行半定量分析。分別統計3組切片陽性反應的平均吸光度(A)值。

1.6 檢測腎臟組織中RARα和阻抑素mRNA的表達 從-80℃冰箱中取50 mg的新鮮冰凍腎臟組織，采用TRIzolTMLS Reagent試劑盒提取組織的總RNA，采用紫外分光光度計測A260、A280值及其比值，并計算RNA含量，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性和是否有降解，確定RNA完整后采用反轉錄試劑盒進行反轉錄。冰上充分溶解反轉錄試劑盒中相關試劑后行下列操作：PCR管中加入總RNA 0.3 μg,Oligo(dT)Primer 1 μL,再加無RNA酶水至12 μL,置于65℃下孵育5 min；然后在各個PCR管中加入2 μL 10 mmol/L dNTP混合物、4 μL 5×反應緩沖液、1 μL RevertAidTMM-MuLv和1 μL核糖核酸酶抑制劑，反應體系總體積20 μL，PCR儀上42℃ 60 min、70℃ 5 min完成返轉錄，獲得cDNA。將cDNA放置于-20℃冰箱中貯存和備用。根據TakaRa公司生產的PCR反應體系(貨號：RR820A)配置反應體系。反應體系(20 μL)：cDNA 1 μL,PCR上游引物(10 μM)0.5 μL,PCR下游引物(10 μM)0.5 μL，2.5×RealMasterMix/SYBR溶液9 μL，超純水9 μL。 PCR反應條件：預變性時間為95℃ 10 min，變性68℃ 15 s，退火60℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，循環數設定為40。于ABI 7500熒光定量PCR儀進行PCR反應。采用β肌動蛋白作為內參，引物由上海生工公司設計和合成。RARα上游引物為5′-ATGTTCCCCAAGATGCTGAT-3′，下游引物為5′-CTGTCCGCTTAGAGTGTCCAA-3′；阻抑素：上游引物為5′-AAGCAGAGAGAGCCAGATTTGT-3′，下游引物為5′-TGATAAGCAATGTCCTCAGCAG-3′；β肌動蛋白：上游引物為5′-GCCCCTGAGGAGCACCCTGT-3′，下游引物為5′-ACGCTCGGTCAGGATCTTCA-3′。采用相對定量2-△△Ct法[9]計算RARα、阻抑素mRNA的相對表達量，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，△△Ct=△Ct(試驗組)-△Ct(對照組)。以假手術組為對照組，其各目的基因mRNA表達量為1。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗；采用Pearson檢驗進行相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠的RIF指數比較 Masson染色顯示，腎小管及腎間質細胞胞漿、肌纖維染為紅色，細胞核為藍色，膠原纖維則染為綠色為陽性。RIF模型組腎間質綠色陽性面積較假手術組明顯增大，說明RIF模型構建成功。造模后的第2周末和第4周末，假手術組、ATRA組、RIF模型組的RIF指數依次升高(均P<0.05)；在ATRA組、RIF模型組，第4周末的RIF指數均高于第2周末(均P<0.05)。見圖1和表1。

表1 3組大鼠的RIF指數比較(x±s，%)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

圖1 3組大鼠腎臟組織Masson染色結果(×400)

2.2 3組大鼠腎小管間質ColⅣ和FN蛋白表達水平比較 造模后的第2周末和第4周末，假手術組、ATRA組、RIF模型組的ColⅣ和FN蛋白相對表達水平依次升高(均P<0.05)；在ATRA組、RIF模型組，第4周末的ColⅣ和FN蛋白相對表達水平均高于第2周末(均P<0.05)。見圖2～3和表2。

表2 3組大鼠腎小管間質ColⅣ和FN蛋白的相對表達水平比較(x±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

圖2 3組大鼠腎臟組織ColⅣ蛋白表達情況(免疫組化染色，×400)

圖3 3組大鼠腎臟組織FN蛋白表達情況(免疫組化染色，×400)

2.3 3組大鼠腎臟組織RARα、阻抑素蛋白和mRNA的表達水平比較 造模后的第2周末和第4周末，假手術組、ATRA組、RIF模型組的RARα、阻抑素的mRNA及蛋白相對表達水平依次降低(均P<0.05)；在ATRA組、RIF模型組，第4周末RARα、阻抑素的mRNA及蛋白相對表達水平均低于第2周末(均P<0.05)。見表3～4及圖4～5。

表3 3組大鼠腎臟組織RARα及阻抑素蛋白的相對表達水平比較(x±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

表4 3組大鼠腎臟組織RARα及阻抑素mRNA的相對表達水平比較(x±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

圖4 3組大鼠腎臟組織RARα蛋白表達情況(免疫組化染色，×400)

圖5 3組大鼠腎臟組織阻抑素蛋白表達情況(免疫組化染色，×400)

2.4 相關性分析 模型組中，第2、4周末時，RARα蛋白表達水平與阻抑素蛋白表達水平均呈正相關(r=0.776，P=0.001；r=0.896，P=0.001)；RAR α蛋白表達水平與RIF指數、ColⅣ蛋白和FN蛋白表達水平均呈負相關(r=-0.823、-0.845、-0.875，P=0.001、0.001、0.001；r=-0.889、-0.879、-0.816，P=0.001、0.001、0.001)。

3 討 論

ATRA是維生素A重要的一種衍生物，目前有不少學者發現其具有抗細胞外基質積聚及抗纖維化的作用[10-12]，但其抗RIF的機制尚不明確。部分研究表明ATRA可以發揮腎臟保護性作用。如Zhang等[13]通過阿霉素構建腎小球硬化大鼠模型進行研究，發現ATRA可能通過抑制瞬時受體電位陽離子通道6的表達，起到延緩腎小球硬化的作用。Tamaki等[14]對糖尿病腎病小鼠模型進行研究發現，ATRA可能通過RARα抑制骨形態發生蛋白4的表達，發揮減輕糖尿病小鼠腎小球基質積聚的作用。Liu等[15]通過5/6腎臟組織切除方法構建腎小球硬化大鼠模型，發現經ATRA治療后腎小球硬化大鼠腎臟組織纖溶酶原激活物抑制劑-1和α平滑肌肌動蛋白表達下降，腎小球硬化延緩，腎功能得到改善。本研究進一步探討ATRA是否可通過RARα調控阻抑素的表達，起到延緩RIF的作用。

本研究結果顯示，與假手術組比較，RIF模型組大鼠腎臟組織RIF指數、ColⅣ和FN蛋白表達增加(P<0.05)，且第4周末的水平均高于第2周末，說明該組大鼠的RIF在進展；而RIF模型組RARα、阻抑素的mRNA和蛋白表達水平均較假手術組下降，且第4周末的水平更低，且RAR α蛋白表達水平與RIF指數、ColⅣ蛋白和FN蛋白表達水平均呈負相關，這提示RARα可能是RIF的保護性因子。采用ATRA治療后，雖然第4周末ATRA組大鼠RIF指數、ColⅣ和FN蛋白表達亦高于第2周末，但各個時間點其水平均較RIF模型組下降(P<0.05)，提示ATRA可延緩大鼠RIF的進展。此外，造模后的第2周末和第4周末，ATRA組大鼠RARα、阻抑素的mRNA和蛋白表達水平均高于RIF模型組，且RIF大鼠的RARα蛋白表達與阻抑素蛋白表達水平呈正相關(均P<0.05)，因此我們推測ATRA可能通過上調RARα表達，對阻抑素表達進行調控，從而發揮延緩RIF進展的作用。

綜上所述， ATRA能抑制RIF大鼠腎臟組織ColⅣ和FN的表達，同時，還可能通過上調RARα表達，以調控阻抑素的表達，從而起到延緩RIF進展的作用，但具體機制有待體外實驗進一步研究。