慢性腎病大鼠心功能損傷情況及其與內質網應激的關系▲

常晉瑞 王 雪 金卓然 南 瑛 曹 健 王 倩 朱永香 孫 娜 孔令恒

(西安醫學院基礎醫學部生理教研室，陜西省西安市 710021，電子郵箱：changjinrui8602@163.com)

慢性腎病患病率逐年增高，已成為全球范圍內的公共健康問題。一些國家和地區慢性腎病患病率為8%～16%[1]，我國成年人群中慢性腎病的患病率為10.8%，且呈不斷上升趨勢[2]。70%的慢性腎病患者并發心血管疾病(cardiovascular disease,CVD) ，且慢性腎病患者尤其是青壯年患者，其CVD相關死亡率顯著高于普通人群，為普通人群的10～20倍[3]。超聲心動圖研究結果提示，終末期腎病患者普遍存在左室肥厚、收縮/舒張功能障礙和心室擴張[4]。因此，預防和早期診治CVD以降低慢性腎病患者心血管事件相關病死率，已成為亟待解決的臨床問題。內質網應激參與了慢性腎病、糖尿病等多種代謝相關慢性病的發生發展[5-6]。然而，內質網是否參與慢性腎病所引起的心肌損傷仍不清楚。本研究采用5/6腎切除法制備慢性腎病大鼠模型，探討慢性腎病大鼠心功能損傷時的內質網應激反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16只無特定病原體級健康雄性SD大鼠[許可證號:SCXK(陜)2012-003]購于西安交通大學醫學部實驗中心，體重(200±20)g。所有動物實驗均遵循西安醫學院實驗動物管理章程并獲得倫理委員會的批準，實驗前24 h禁食，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器 尿素氮(批號：C013-2-1)和肌酐試劑盒(批號：C011-2-1)購自南京建成生物工程研究所。葡萄糖調節蛋白94(glucose-regulated protein 94,GRP94)抗體(批號：ab13509)、 轉錄激活因子(activating transcription factor,ATF)4抗體(批號：ab23760)和ATF6抗體(批號：ab203119)購自美國Abcam公司；CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)抗體(批號：2895)購自美國CST公司；β-肌動蛋白 (批號：sc-517582)和所有二抗購自美國Santa Cruz公司。化學發光試劑盒購自北京普利萊技術公司。BL-420F生物信號采集與分析系統購自成都泰盟軟件有限公司。

1.3 動物分組與模型制備 采用隨機數表法將16只大鼠分為對照組和慢性腎病組，每組8只。慢性腎病大鼠模型的制備方法[7]：采用1.5%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切除右腎，7 d后切除2/3左腎。對照組用同樣的方法麻醉大鼠后只撕脫腎包膜，不切除腎。腎切除術12周后，測定兩組大鼠腎功能和心功能，大鼠尿素氮和肌酐水平以及左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)升高提示模型成功。

1.4 觀察指標

1.4.1 腎功能測定：腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(1 g/kg) ，成功麻醉動物,無菌條件下打開腹腔。采集腹主動脈血于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min后，取上清，采用尿素氮和肌酐試劑盒測定大鼠血清中尿素氮和肌酐含量，嚴格按照說明書進行操作。

1.4.2 心功能測定：用20%氨基甲酸乙酯(1 g/kg) 腹腔注射麻醉大鼠后，暴露氣管和左側頸動脈，將充滿肝素(200 U/mL)的動脈導管插入頸動脈，連接BL-420 F生物機能實驗系統，連續監測收縮壓，將PE導管順頸動脈插入左心室，監測LVEDP，均連續監測15 min。監測完畢后取出心臟并稱重,計算心臟重量指數(heart weight index,HWI),HWI=心臟重量/體重。

1.4.3 內質網相關蛋白表達水平的檢測：采用免疫印跡法檢測內質網相關蛋白的表達水平。動物處死后取心肌約50 mg，加1 000 μL裂解緩沖液，勻漿后12 000 r/min離心10 min取上清，用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(西安赫特生物有限公司，批號：WB003)測定蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，相應一抗稀釋液(GRP94:1 ∶2 000；CHOP:1 ∶500；ATF4:1 ∶1 000；ATF6:1 ∶1 000)4℃孵育過夜，二抗(1 ∶3 000)室溫孵育1 h，加入適量的電化學發光液進行曝光顯色。 以β-肌動蛋白為內參,以目的蛋白的灰度值比β-肌動蛋白灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.5 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.00軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠的一般情況 建模12周后慢性腎病組大鼠體重為(373.0±12.98)g，低于對照組的(497.4±11.93)g(t=7.056，P=0.001)。慢性腎病組大鼠活動尚可，但毛發干枯，尿量較對照組增加。

2.2 兩組大鼠腎功能及心功能指標比較 慢性腎病組大鼠血漿尿素氮、肌酐水平，HWI、收縮壓、LVEDP均高于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組腎功能及心功能指標比較(x±s)

2.3 兩組大鼠內質網相關蛋白表達水平比較 慢性腎病組大鼠心肌組織GRP94、CHOP、ATF4和ATF6蛋白的表達水平均高于對照組(均P<0.05)，見表2及圖1。

圖1 兩組大鼠內質網相關蛋白表達水平

表2 兩組大鼠內質網相關蛋白相對表達水平比較(x±s)

3 討 論

內質網是細胞內除核酸以外的一系列重要的生物大分子合成的場所，是重要的細胞器。當各種病理因素導致內質網穩態失衡后，細胞內相應的信號通路發生改變，引發一系列的反應，稱之為內質網應激[8]。經典的內質網應激包括3條主要信號通路：PKR樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/ATF4、肌醇需求激酶1/X盒結合蛋白1和ATF6。適度的、短暫的內質網應激可作為一種防御性的機制減輕細胞功能紊亂，即未折疊蛋白反應，以恢復心肌細胞內蛋白質合成和鈣穩態，從而有利于心肌損傷的修復與代償[9]。已有研究表明，心肌缺血再灌注損傷過程中存在PERK/eIF2α/ATF4介導的內質網應激[10]。模擬心房顫動的快速電場刺激可誘導離體心肌細胞ATF4的表達，并且心房顫動患者心肌細胞核中存在ATF4的表達[11]，提示多種心功能損傷過程中存在內質網應激反應。

腎切除過多導致的腎臟代償不全或腎炎腎病等各種腎臟疾病均可引起腎臟結構和功能損傷，若損傷持續時間超過3個月就稱為慢性腎病。慢性腎病時腎小球濾過慮降低，尿毒素在體內堆積,腎性貧血、高鉀血癥等電解質紊亂使患者的心肌受損,心功能發生改變[12]。為探索內質網應激是否參與慢性腎病相關性心功能損傷的發生過程，我們建立慢性腎損傷大鼠模型，并檢測內置網應激相關蛋白。結果顯示，慢性腎病組大鼠心肌GRP94蛋白、內質網應激信號通路蛋白ATF4和ATF6的表達水平均升高，提示切除5/6腎臟12周后大鼠心肌中存在內質網應激反應。

持續和/或嚴重的內質網應激會導致細胞凋亡，誘導心肌肥厚從而導致心力衰竭[13]。CHOP是ATF4的下游凋亡信號，也是內質網應激介導細胞凋亡的主要途徑[14]。心力衰竭患者的心肌組織中CHOP表達水平升高[15]，而中介素等物質通過抑制CHOP的表達可減輕腹主動脈縮窄誘導的心肌肥厚[16-17]、減少衣霉素誘導的心肌細胞凋亡[18]。本研究結果顯示：慢性腎病組的HWI、收縮壓、LVEDP均高于對照組(均P<0.05)，提示慢性腎病大鼠伴有心功能損傷；慢性腎病組大鼠CHOP表達水平升高，提示慢性腎病大鼠伴心功能損傷時存在內質網應激介導的細胞凋亡。

綜上所述， 慢性腎病大鼠存在心肌損傷，其機制可能與心肌細胞內質網應激及其誘導的心肌細胞凋亡有關。