熱帶山地雨林土壤球囊霉素的分布特征

張夢歌，石兆勇,2,3*，楊梅，盧世川，王旭剛，徐曉峰

1.河南科技大學農學院，河南 洛陽 471000；2.洛陽市共生微生物與綠色發展重點實驗室，河南 洛陽 471000；3.北京大學/地表過程分析與模擬教育部重點實驗室，北京 100871

球囊霉素（GRSP）是植物共生叢枝菌根真菌所分泌的一類含有金屬離子的糖蛋白，是土壤有機質的重要組成部分和重要來源（He et al.，2010），具有穩定和改善土壤結構及提高土壤固定有機碳的能力（吳陽等，2018）。因此，土壤球囊霉素常被作為表征土壤質量和土壤碳庫變化的重要指標（黃彬彬等，2019）。叢枝菌根（AM）是土壤中叢枝菌根真菌（AMF）與植物形成的互惠共生體，是熱帶雨林生態系統中的主要菌根類型，能與熱帶雨林中的絕大多數植物形成共生關系（Smith et al.，2011）。研究表明，叢枝菌根真菌和植物共生可以促進植物吸收土壤中的氮、磷等養分，改善宿主植物的營養狀況，從而有利于植物的生長，為植物提供良好的物質基礎（Barea et al.，2011）。球囊霉素作為叢枝菌根真菌的代謝產物，廣泛存在于土壤生態系統中，在一定程度上反映了叢枝菌根真菌的生長狀況和繁殖能力。Rillig et al.（2003）認為，球囊霉素是土壤C庫和N庫的重要來源，其黏附力有利于穩定土壤結構，是叢枝菌根真菌對植物生長環境的調整與適應。田蜜等（2013）研究認為叢枝菌根不僅能改善土壤結構和植物的營養狀況，還能提高植物對環境脅迫的抗性等功能，對熱帶雨林生態系統具有重要意義。

由于球囊霉素的重要生態功能，使其在各種生態系統土壤中的含量和分布引起了人們的廣泛關注（景航等，2017）。目前對球囊霉素的研究主要集中在農田、草地、荒漠（仲召亮等，2016；郭亞楠等，2017）生態系統。唐宏亮等（2009）在農田生態系統的研究發現，土地利用方式不同而導致了土壤球囊霉素含量的明顯不同。賀學禮等（2018）基于沙化梁地生態系統的研究則表明，球囊霉素含量及分布隨不同坡度的變化而存在明顯的空間異質性。因此，土壤球囊霉素含量在不同生態系統中，具有不同的分布特征。熱帶雨林是功能、結構最為復雜的生態系統，由于研究手段的局限性，前人對熱帶雨林生態系統中球囊霉素的研究，主要集中在相同海拔梯度上，并證明其在熱帶雨林土壤固碳方面發揮著重要作用（Rillig et al.，2001；Lovelock et al.，2004）。但是，熱帶雨林在不同海拔梯度上通常存在著明顯的植被垂直地帶分布，可能會影響到叢枝菌根真菌的群落和多樣性（Bonfim et al.，2016），進而導致其分泌物——球囊霉素含量的差異。因此，通過對山地不同海拔梯度球囊霉素含量及其分布規律的探究，從而準確評價球囊霉素、乃至叢枝菌根在熱帶雨林中所扮演的角色，為今后利用球囊霉素對熱帶山地雨林土壤結構改善方面、土壤養分有效利用方面提供理論依據。本研究選擇我國保存最為完好的熱帶雨林——尖峰嶺為對象，研究了其不同海拔梯度土壤球囊霉素的含量及其空間分布特征，并結合土壤因子的變化，進一步分析了尖峰嶺熱帶雨林土壤球囊霉素的變異機制，以期為熱帶雨林生態功能評價提供新策略。

1 材料與方法

1.1 研究地點概況

本研究選擇海南尖峰嶺熱帶雨林為研究對象。尖峰嶺地區位于海南省西南部（18.33°—18.95°N，108.68°—109.20°E），總面積約640 km2（李艷朋等，2016）。處于低緯度熱帶島嶼季風氣候區，干濕兩季明顯。該地區年平均降水量2449 mm，年平均氣溫24.5 ℃，最高海拔1412 m（方精云等，2004）。選擇尖峰嶺進行研究，是因為尖峰嶺是世界上熱帶雨林植被保存最為完好的地區之一，被認為是“人與生物圈”計劃研究最為理想的地方，類型齊全，可以進行所有學科的研究。

1.2 樣品的采集與處理

在尖峰嶺選擇4個海拔梯度，分別為300、600、900、1200 m，在每個目標海拔高度上設置寬度為50 m的采樣帶；在采樣帶中，以50—100 m水平間隔設置3個20 m×20 m的樣方；每個樣方劃分為25個4×4 m的樣區，在每個樣區，用土鉆隨機采集直徑為2 cm的2個0—30 cm土柱樣品。每個樣方采集50個土壤樣品進行充分混勻，采用逐級四分法，保留約1 kg土壤連同根系樣品，放入裝有干冰的冰盒中帶回實驗室。在實驗室挑選出土壤中的細根，用于測定菌根侵染率，土壤用于測定球囊霉素和土壤理化特性。

1.3 試驗方法

1.3.1 叢枝菌根真菌侵染率和球囊霉素的測定

叢枝菌根真菌侵染率按Phillips et al.（1970）和劉潤進等（2007）的方法測定計算。主要測定步驟：選取新鮮的細根，放入盛有質量分數為10%氫氧化鉀溶液的試管中，90 ℃水浴鍋中加熱30 min。沖洗干凈后加入體積分數5%的醋酸浸泡5 min，然后倒掉醋酸用體積分數 5%的醋酸墨水進行染色，在90 ℃水浴鍋中加熱。染色后挑出30條粗細一致的根段制作裝片放在顯微鏡下觀察侵染情況并記錄結果。計算方法：在顯微鏡下觀察每條根段的侵染情況，根據每段根系菌根結構的多少，按0、10%、20%、30%……100%的侵染數量給出每條根段的侵染率。依照公式可計算該樣品菌根的侵染率：∑(0×根段數+10%×根段數+20%×根段數+……+100%×根段數)/觀察總根段數。

球囊霉素的測定包括易提取球囊霉素和總提取球囊霉素，按Wright et al.（1996）和David et al.（2008）的方法測定。易提取球囊霉素測定的主要步驟：取1 g風干土在試管中，加入8 mL、20 mmol·L-1（pH=7.0）檸檬酸鈉浸提劑，在103 kPa、121 ℃條件下連續提取90 min后，在6000 r·min-1下離心15 min，收集上清液；總球囊霉素提取方法：取1 g風干土于試管中，加入 8 mL、50 mmol·L-1（pH=8.0）檸檬酸鈉浸提劑，在103 kPa、121 ℃條件下連續提取60 min，再重復提取2次；6000 r下離心15 min，收集上清液。分別吸取上清液0.5 mL加入5 mL考馬斯亮藍G-250染色劑，在595 nm波長下比色。用牛血清蛋白作為標準液，考馬斯亮藍法顯色，繪制標準曲線，求出球囊霉素含量。

1.3.2 土壤理化性質的測定

土壤全碳、全氮含量用元素分析儀測定（張威等，2009），土壤全磷含量測定采用高氯酸-濃硫酸消煮-鉬銻抗比色法測定（魯如坤，2000），土壤pH采用精密酸度計（pHS-3C）測定。

1.4 數據處理

對土壤 T-GRSP、EE-GRSP、植物根系的菌根侵染率和GRSP與土壤全碳的比值，采用在4個海拔間進行P＜0.05水平上單因素方差分析的方法，具體用 Duncan多重比較法檢驗其差異的顯著性。對于土壤因子（全碳、全氮、C/N、pH、全磷）對GRSP含量的影響，則采用線性回歸的方法進行分析。所有數據都運用SPSS 21.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同海拔叢枝菌根真菌的侵染狀況

圖1 不同海拔（H）叢枝菌根真菌的侵染狀況（C）Fig.1 Colonization status (C) of arbuscular mycorrhizal fungi at different altitudes (H)

對尖峰嶺不同海拔根系進行菌根侵染率的測定，叢枝菌根真菌在不同海拔梯度均能與根系形成較好的共生關系，4個海拔的平均侵染率達到82.92%（圖1）。從4個海拔的菌根侵染率來看，僅在600 m和1200 m之間存在顯著的差異，在海拔600 m時，菌根侵染率最低，也達到74.88%，而在1200 m時最高，為92.86%?？梢?，在尖峰嶺的各海拔中，叢枝菌根的侵染率都比較高，且受海拔梯度變化的影響較小。

2.2 不同海拔土壤因子的含量

對尖峰嶺不同海拔梯度土壤因子含量及C/N的測定發現，土壤全碳和全氮含量在各個海拔的變化一致，都是在1200 m海拔時顯著高于其他3個低海拔（表1）。C/N隨海拔的升高呈現顯著增大的趨勢。pH在各海拔的變化范圍在4.85—5.48之間，且2個低海拔與2個高海拔相比，土壤pH呈現顯著性變化。尖峰嶺土壤全磷含量在0.18%—0.29%之間，只有在300 m海拔和600 m海拔時差異顯著。

2.3 不同海拔土壤球囊霉素的含量及其對土壤碳的貢獻

尖峰嶺不同海拔梯度土壤總提取和易提取球囊霉素含量的變化范圍分別為1.79—3.11 mg·g-1和0.75—1.13 mg·g-1，兩項測試指標的最大值均出現于1200 m 的海拔，分別為 3.11 mg·g-1和 1.13 mg·g-1（圖2）。不同的海拔梯度間，總提取和易提取球囊霉素含量的變化規律一致，都是在900 m以下低海拔梯度時，總提取和易提取球囊霉素含量差異不顯著，而與海拔1200 m相比，存在顯著性的差異。球囊霉素作為土壤碳庫的重要來源，通常用土壤球囊霉素與土壤全碳的比值，來測定球囊霉素對土壤碳庫的貢獻（圖 2）。尖峰嶺土壤總提取球囊霉素與易提取球囊霉素對土壤全碳的貢獻范圍分別為4.33%—8.87%、1.58%—4.12%。總提取球囊霉素與易提取球囊霉素在4個海拔梯度間，對土壤全碳的貢獻呈現相同的規律，都是在海拔1200 m時，顯著低于其它低海拔對土壤全碳的貢獻值。

2.4 球囊霉素含量與土壤因子間的關系

通過對球囊霉素與土壤因子（全碳、全氮、磷、pH）間的分析表明，總提取球囊霉素和易提取球囊霉素均與土壤全碳、全氮、碳氮比的含量呈顯著正相關關系（圖3）。對于碳而言，土壤總提取球囊霉素隨著碳含量的增加而增大，兩者呈現線性關系，解釋率為63.16%，即土壤全碳每增加1%，總提取球囊霉素就增加0.21 mg·g-1。碳與土壤易提取球囊霉素的含量也呈線性相關關系。隨著土壤中全氮含量的增大，土壤總提取球囊霉素和易提取球囊霉素都呈現線性增加的趨勢。與碳相似，總提取球囊霉素與土壤全氮線性關系的解釋率高于易提取球囊霉素，分別為58.94%和32.19%。土壤總提取球囊霉素和易提取球囊霉素隨著碳氮比的增加顯著增大。且土壤總提取、易提取球囊霉素含量與全碳、全氮、碳氮比都呈極顯著相關關系（P＜0.01）。土壤總提取球囊霉素與易提取球囊霉素含量都隨 pH的增大而呈現下降的趨勢，但 pH與易提取球囊霉素呈顯著相關關系（P＜0.05），而與總提取球囊霉素沒有相關關系（P＞0.05）磷含量與總提取球囊霉素和易提取球囊霉素也沒有明顯的相關關系（P＞0.05）。

表1 不同海拔高度土壤因子的含量Table 1 Contents of Soil Factors at Different Altitudes

圖2 不同海拔土壤球囊霉素（GRSP）的含量及其對土壤碳的貢獻（r）Fig.2 The content of glomalin (GRSP) in soil at different altitudes and its contribution (r) to soil carbon

3 討論

熱帶雨林植被是叢枝菌根植物占優勢物種的區域（Camenzind et al.，2016；Shi et al.，2019），本研究的結果表明，在尖峰嶺4個海拔植物的菌根侵染率都很高，處于74.88%—92.86%之間，平均達到82.92%，這與以往的研究結果類似，如石兆勇等（2007）針對五指山植物叢枝菌根共生狀況的研究中，就表明侵染率最高可達90.5%。Shi et al.（2006）針對熱帶 Meliaceae科的植物的研究，其菌根侵染率也高達95%。鄂曉偉等（2019）對亞熱帶闊葉林的研究也得到了相似的結論?？梢?，熱帶雨林植物能夠與叢枝菌根真菌形成良好的共生關系。從4個海拔的侵染率來看，僅在600 m和1200 m之間存在顯著差異，這可能是與菌根侵染率隨海拔變化的規律不一致所導致的，如Shi et al.（2014）在秦嶺太白山 19個海拔的研究表明，菌根侵染率隨海拔呈現出三次方程函數的變化關系；而趙飛等（2015）針對青藏高原的5個海拔梯度的研究發現，植物的菌根侵染率除在最高海拔處顯著低于其它4個低海拔區域外，4個低海拔間無顯著差異?？梢姡参锏木秩韭孰S海拔的變化，并無一致的規律，這可能也與土壤因子有關（Camenzind et al.，2016）。當然，針對于不同的區域和生態系統的情況，還有待進一步探討。

尖峰嶺土壤總提取和易提取球囊霉素含量在 3個低海拔土壤中的變化不顯著，僅在1200 m時顯著高于低海拔土壤球囊霉素的含量，與祝飛（2010）在熱帶地區關于球囊霉素的研究結果一致，其原因可能是隨著海拔的升高，人為干擾程度降低，光照比較充足，因此導致球囊霉素含量高于其他海拔，且在1200 m時，叢枝菌根真菌與根系的侵染率也最高，這一結果和分泌的球囊霉素最高是一致的。有研究表明，不同生態系統中總提取球囊霉素含量范圍為2.0—14.8 mg·g-1（張亞娟，2017），但生態系統之間土壤球囊霉素的含量差異明顯。王建等（2016）的研究發現耕地及果園等長期耕作的土壤中球囊霉素含量低于林地、草地。本研究中發現尖峰嶺土壤總提取球囊霉素平均含量為2.205 mg·g-1，易提取球囊霉素的平均含量為 0.904 mg·g-1，高于張亞娟等（2017）在荒漠地區所測定的球囊霉素含量。在4個海拔土壤中易提取球囊霉素占土壤全碳的 1.58%—4.12%，總提取球囊霉素占土壤全碳的4.33%—8.87%，高于Rillig et al.（2001）所研究的在熱帶山地雨林中，總提取球囊霉素占到整個土壤全碳含量的4%—5%。可能是由于近年來，災害天氣、農工業化污染等自然因素和人類活動引發了一系列生態問題，導致生態系統服務功能衰減；氣候的改變導致土壤養分含量流失（李珂等，2017），所以球囊霉素占土壤全碳的含量有所提高。這充分說明球囊霉素是土壤碳庫的重要來源和組成部分。也有研究表明，球囊霉素是一類難溶于水，難于分解，并且在土壤中性質極為穩定的蛋白質（王建等，2016），因此球囊霉素的含量也與成土時間有關。本研究中海拔對熱帶山地雨林球囊霉素含量的有限影響，可能是受樣地環境因素和植物種類等多種因素綜合影響的結果。

有研究表明，熱帶森林在全球碳循環中起著非常重要的作用，熱帶森林土壤碳儲量占全球碳庫的11%（Malhi et al.，1999）。本研究中，尖峰嶺土壤平均全碳含量為4.04%，與周李磊等（2016）所研究的新疆伊犁草地生態系統中土壤的全碳含量（4.25%）相近。土壤中的氮主要來源于凋落物歸還，大氣沉降以及固氮植物（蒲潔等，2015）。本研究中全氮含量范圍為1.65—4.25 mg·g-1，平均全氮含量為2.48 mg·g-1，高于我國陸地土壤全氮含量水平（2.3 mg·g-1）（Tian et al.，2010）?？赡苁请S著海拔的升高，氣溫逐漸降低導致土壤全氮礦化速率變弱，所以在海拔1200 m時土壤全氮含量最高。張巧明等（2011）研究發現秦嶺土壤全氮在高海拔時含量較高，其結果與本研究一致。土壤C/N是衡量有機質分解速率、評價土壤質量的敏感指標。在尖峰嶺熱帶山地雨林中，C/N的平均值變化范圍在12.43—18.68之間，高于我國土壤 C/N的平均值10—12（朱秋蓮等，2013）。證明尖峰嶺土壤有機質分解速度較好。在球囊霉素含量與土壤因子關系的研究中發現，總提取和易提取球囊霉素含量隨著土壤全碳含量、全氮含量、C/N含量的增加而增加，且都呈現極顯著正相關關系，近一步證實了球囊霉素是土壤碳庫和氮庫的重要來源，這與謝靖等（2012）的研究結果一致。尖峰嶺土壤平均全磷含量為 0.23 mg·g-1，遠低于全國平均水平（0.56 mg·g-1）（Tian et al.，2010）。顯著性分析結果也表明，總提取和易提取球囊霉素含量與土壤全磷含量沒有明顯的相關關系?？赡苁且驗榱鬃鳛橐环N沉積性的礦質元素，在土壤中的遷移率很低，主要依靠巖石的風化，其含量相對穩定（張亞娟等，2017），因此土壤全磷含量在整個空間中的分布較為均勻。本研究尖峰嶺土壤pH的變化范圍在4.93—5.48之間，與易提取球囊霉素含量呈現顯著負相關關系，但與總提取球囊霉素的含量沒有顯著性影響?？赡苁且驗樘崛∏蚰颐顾貢r浸提劑有pH的要求，而酸性土壤干擾易提取球囊霉素的測定。測定總提取球囊霉素時浸提了多次，消除了其對總提取球囊霉素的干擾。因此可說明在微酸性環境中，植物能與叢枝菌根真菌形成良好的共生關系，且對分泌球囊霉素沒有影響。

圖3 球囊霉素含量與土壤因子間的關系Fig.3 The relationship between glomalin content and soil factors

4 結論

（1）熱帶山地雨林尖峰嶺土壤中有較高的球囊霉素含量，其植物根系具有較高的侵染率。

（2）在尖峰嶺熱帶雨林中，海拔對于土壤球囊霉素含量具有有限的影響。

（3）熱帶山地雨林土壤球囊霉素含量隨土壤全碳、全氮、C/N的增加而增加。