sPD-1、IFY-γ、IL-12、IL-10及T淋巴細胞CD4+、CD8+在慢性乙肝患者血漿中的表達及臨床意義

柯淑慧 楊偉琴 吳炳 張涵斌

(1浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310000；2臺州市椒江區婦幼保健院檢驗科；3臺州市仙居縣中醫院檢驗科；4臺州市黃巖區婦幼保健院檢驗科)

全世界范圍內有超過2.4億人感染慢性乙型肝炎病毒(HBV)。在乙肝最流行的亞太地區，慢性HBV感染是肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌的主要原因。慢性乙型肝炎的臨床實驗表明發病機制中細胞因子白細胞介素(IL)-12與干擾素(IFN)-γ發揮很大作用。可溶性程序性死亡受體(sPD)-1是一種表達于多種人體免疫系統的分子，包括T細胞、B細胞、骨髓細胞、胸腺細胞和自然殺傷細胞，sPD-1表達與癌癥和慢性感染中的T細胞衰竭有關。在HBV患者衰竭T細胞上存在的許多抑制性受體中，PD-1表達最高，特別是在肝臟內HBV特異性T細胞上。PD-L1是PD-1的主要配體之一，通常發現于肝臟細胞中，在慢性感染環境中其表達增加。免疫細胞sPD-1表達上調可在病毒感染〔如HBV、人類免疫缺陷病毒(HIV)〕中檢測到，表明sPD-1可能是影響感染持續性的一個重要因素〔1〕。了解患者體檢的各項指標對臨床中患者的預后具有重要意義，此次研究通過監測慢性乙肝患者血漿中sPD-1、IFY-γ、IL-12、IL-10指標明確其對患者預后的影響。

1 資料和方法

1.1研究對象 選取2017年9月至2018年11月于臺州市椒江區婦幼保健院、臺州市仙居縣中醫院及臺州市黃巖區婦幼保健院三家醫院的慢性乙型肝炎患者100例，其中男80例，女20例，年齡62～75歲，其中中期慢性肝炎52例，晚期慢性重型肝炎48例。診斷符合2000年西安全國肝病會議《病毒性肝炎防治方案》的診斷規范〔2〕。根據患者的治療效果、乙型肝炎相關慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)存活者長期預后及健康相關的生存質量將其分為兩組：好轉組80例，平均年齡(65.1±3.2)歲；死亡組20例(均為晚期患者)，平均年齡(67.8±2.6)歲。選擇同期體檢的健康者100例為對照組，年齡66～78歲，平均(68.4±4.2)歲。3組一般資料均無顯著性差異，具有可比性(P<0.05)，該研究獲得醫院倫理學委員會的批準。

1.2觀察指標 檢測受試對象血漿中sPD-1、IL-10、IL-12、IFN-γ的含量，外周血中T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平及肝功能指標谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰基轉移酶(GT)。sPD-1，IL-10，IL-12、IFN-γ、ALT、AST及γ-GT 酶聯免疫檢測試劑盒均購于Biolegend；T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+流式細胞學檢測試劑盒均購于北京鼎國生物技術有限公司。

1.3檢測方法 3組均采取外周血10 ml，置于肝素抗凝管中，1 500 r/min，離心10 min，取血漿3.0 ml，保存在-80℃冰箱中，檢測時應用37℃水浴解凍，應用雙抗體夾心法檢測血漿sPD-1，IL-10，IL-12和IFN-γ水平。取2 ml肝素抗凝血，加磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至4 ml，緩慢加至2 ml Ficoll淋巴分離液上層，2 000 r/min離心20 min后吸取單個核細胞。PBS洗滌后將細胞重懸于100 μl PBS，與抗體異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4、Percp-CD8孵育30 min，PBS洗滌2遍后重懸于500 μl PBS，在流式細胞儀Beckman Coulter Navios進行檢測。

1.4統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、Pearson檢驗、Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1各組血漿中sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ指標的比較 好轉組與對照組sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ含量明顯低于死亡組(均P<0.05)。好轉組SPD-1、IL-12水平顯著高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組血漿中sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ指標的比較

與死亡組相比：1)P<0.05；與對照組相比：2)P<0.05

2.2各組外周血中T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平比較 死亡組CD4+水平為(45.8±7.2)%，好轉組為(37.8±5.3)%，對照組為(46.6±3.4)%；而死亡組CD8+水平為(39.1±3.8)%，好轉組為(32.2±6.2)%，對照組為(27.1±4.7)%。死亡組和好轉組CD4+水平明顯低于對照組(P<0.05)、CD8+水平明顯高于對照組，差異顯著均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組外周血中T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平

2.3sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ與肝功能指標的相關性 與對照組相比，好轉組和死亡組ALT、AST、γ-GT均顯著升高(均P<0.05)。見表2。sPD-1、CD4+水平與肝功能指標(ALT、AST、γ-GT)呈正相關(r=0.639、0.712、0.598、0.726、0.703、0.608，均P<0.05)；IL-10水平與ALT、AST、γ-GT呈正相關(r=0.546、0.642、0.575，均P<0.05)；IL-12、IFN-γ與肝功能指標無明顯相關。

表2 各組肝功能指標的比較

與對照組相比：1)P<0.05

2.4sPD-1、IL-10對慢性重型肝炎的預后分析 Logistic回歸模型顯示，血漿內sPD-1、IL-10含量高的患者風險較大(sPD-1:HR=1.002,95%CI:0.780～1.262;IL-10:HR=1.005,95%CI:0.653～1.482)。

3 討 論

慢性乙型肝炎后期表現有乏力、納差、腹脹等，可伴有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣或肝脾腫大。慢性乙型肝炎患者病情不同階段生理表達不同，早期呈現細胞因子IL-10大量分泌，早期是醫治痊愈的最好時期，中期到后期IL-12與ILN-γ的含量極速增長，早期應用肝細胞生長素可降低病死率〔3〕。IFN-γ、IL-12和IL-10代表體內Th1與 Th2反應，(IFN-γ+ IL-12)/IL-10比值變化代表人體免疫反應的方向，如果比值偏小，則提示慢性化可能，Child-Pugh、終末期肝病模型(MELD)和白蛋白-膽紅素(ALBI)評分預測肝硬化合并慢加急性肝衰竭患者院內死亡風險〔4〕，如果比值偏大，則提示機體含有劇烈的免疫反應。若早期細胞因子IL-10分泌則該患者痊愈概率大，若觀察指標含量以IFN-γ與IL-12的增多為主，且遠遠高于正常指標含量，則可判斷該患者為慢性重型肝死亡。慢性肝炎患者在不同病情階段血漿中各指標含量不同，早期以IL-10含量增多為主。患者往往存在嚴重的血小板減少現象，晚期則以IFN-γ和IL-12分泌含量快速增長為主。肝衰竭死亡時期依次隨時間推移IL-12與IFY-γ含量增多，抑制細胞因子分泌是防治慢性肝炎的可能的方法之一。

慢性乙型肝炎病毒感染的過程是一個動態的過程，是病毒復制和宿主免疫相互作用的結果。T細胞異常表達免疫分子參與慢性乙肝的病理過程〔5～7〕，機體感染乙肝病毒后可發生T淋巴細胞亞群改變。PD-1為近年發現的T細胞表面CD28家族新成員〔8～10〕，但PD-1在乙肝中的具體機制不明確，有研究表明PD-1介導的負向調控與慢性病毒感染有密切關系〔11～13〕。研究證實，抑制T細胞過度表達的PD-1及其受體PD-L1可有效抑制乙肝病毒，有望成為治療肝癌的新型治療方法〔14～21〕。