響應面法優化大豆豆莢甾醇提取工藝的研究

諸愛士 金志強 潘明緯 黃鑫磊 李嘉雄 石嫣雯

(浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州 310023)

大豆[Glycinemax(Linn.)Merr.]通稱黃豆，為雙子葉植物綱、豆科、大豆屬的一年生草本，原產中國，中國各地均有栽培，亦廣泛栽培于世界各地。大豆是中國重要糧食作物之一。大豆莢殼是大豆子實脫殼后的副產品，資源豐富，一般被作為飼料、燃料或堆肥等，但其含有多種生理活性物質[1-3]、膳食纖維[4]和微量元素[5]，如張蒙等[1]報道了從大豆莢乙醇提取物中分離得到 14 個化合物，有酯、酚、酮、酸、甾醇等；Boué等[2]采用液相色譜—質譜聯用法鑒定了大豆豆莢中黃酮類苷元和糖苷；王純榮等[3]利用表面活性劑協同超聲波提取了大豆豆莢中黃酮；趙麗等[4]采用不同的提取方法從鮮食大豆莢中提取膳食纖維；曹葉霞等[5]報道了大豆莢中含有鐵、鋅和錳等。文獻也報道了大豆莢利用的相關研究，如Huang等[6]研究了大豆莢殼的理化性質及其對倉鼠腸道健康的促進作用；Sruamsiri等[7]研究了大豆莢殼作為飼料的營養及消化率；趙衛星等[8]應用大豆莢殼提取物來抑制線蟲的活性；薛媛等[9]將大豆莢改性制備吸附劑應用于甲基藍廢水的吸附；李翠華等[10]將大豆莢作為能源生物質與褐煤混合，研究了其熱解過程。植物甾醇是一種廣泛存在于植物中的天然活性物質，具有許多生理功能[11, 12]，廣泛應用在食品、醫藥、化妝品、動物生長劑及紙張加工、印刷、紡織等領域。但關于從大豆莢中提取甾醇的具體工藝及優化的研究鮮見報道。本研究以乙醇水溶液為溶劑從大豆莢中提取甾醇，先考察了多個因素對甾醇提取收率的影響，然后選擇影響顯著的液料比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度進一步采用四因素三水平的Box-Behnken設計響應面法優化了提取工藝條件，使甾醇的收率更高，并對建立的模型進行了分析，為大豆莢甾醇提取規?；瘧锰峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗材料：老大豆莢，產地浙江義烏。

試劑：豆甾醇(標準品)，乙醇(分析純)，硫酸(分析純)，磷酸(分析純)，氯化高鐵(分析純)。

儀器與設備：DK-S24型電熱恒溫水浴鍋；WFJ型可見分光光度計；800B型離心機。

1.2 方法

1.2.1 原料的預處理

將曬干的大豆莢粉碎成5～10 mm的碎片，在干燥箱中于50 ℃干燥恒重，稱重分包待用。

1.2.2 豆莢甾醇提取

恒溫水浴鍋分別設置為50.0、60.0、70.0、80.0、90.0 ℃，待其恒溫；稱取3.0 g準備好的干燥原料，將其裝入250 mL三口燒瓶，分別按液料比15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 mL/g加入待考察體積分數(60.0%、70.0%、80.0%、90.0%、100.0%)的乙醇水溶液，將燒瓶固定在恒溫水浴中，中間口加攪拌槳，控制所需考察的轉速(0、50、100、150、200、250 r/min)，側口裝冷凝管，進行提取，達到設定的考察提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)結束提取操作，而后迅速將燒瓶從水浴中取出，用自來水冷卻至室溫，然后從燒瓶中取出混合料液，并用少量水清洗燒瓶，合并提取液后測定其總體積，取適量提取液用離心機在1 000 r/min下離心10 min，取上清液，測定提取液中的甾醇質量濃度，并計算出甾醇收率。

1.2.3 甾醇質量濃度測量及收率計算

甾醇的質量濃度按磷硫鐵法[13]進行分析測定，測定溶液吸光度后再用標準曲線方程經換算而得。

10%FeCl3配制：稱取FeCl3·6H2O試劑10 g放入燒杯，將其用85%的磷酸溶解，并用磷酸定容至100 mL，貯于棕色瓶中備用。

磷硫鐵顯色劑配制：用移液管移取1.5 mL配制好的10%FeCl3溶液放入100 mL棕色容量瓶中，用濃硫酸定容至刻度，放入棕色瓶中備用。

標準曲線繪制：精密稱取豆甾醇標樣5.000 mg，將其溶于無水乙醇中，并用無水乙醇定容至10 mL，得質量濃度為0.500 mg/mL的豆甾醇乙醇溶液，將其貯于棕色瓶中，低溫保存備用。使用時吸取儲備液2.5 mL，用無水乙醇定容至25.0 mL，得豆甾醇使用液，質量濃度為50 μg/mL。

取6支10 mL干燥過的刻度試管，編號后均加入2.0 mL磷硫鐵顯色劑，分別加入0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL的0.500 mg/mL豆甾醇溶液，并分別加入4.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 mL的無水乙醇；而后在室溫下顯色15 min，用分光光度計在520 nm 下分別測定吸光度，以豆甾醇質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。線性擬合，得方程(1)：

A=0.001 6X-0.007 3

(1)

式中：X為甾醇質量濃度(以豆甾醇計)/μg/mL；A為溶液在520 nm下的吸光度，相關系數R2=0.998 9。

樣品中總甾醇含量測定：準確移取2.0 mL樣品液放入刻度試管，而后加入2.0 mL無水乙醇，再加入2.0 mL配制好的磷硫鐵顯色劑搖勻，顯色15 min后在波長520 nm處測定其吸光度(如吸光度超過0.9，為保證精度則需對樣品液進行稀釋后再測定), 按式(1)計算出樣品液中的總甾醇質量濃度，代入式(2)進一步計算相應的甾醇收率。

(2)

式中：Y為甾醇收率/mg/g；X為提取液中甾醇的質量濃度/μg/mL；V為提取液定容后總體積/mL；B為分析時樣品稀釋倍數；M為每次提取實驗豆莢的投料量/g。

1.2.4 實驗設計

單因素實驗：原料投料，料液攪拌，提取1次，分別對物料類型、乙醇體積分數、液料比、攪拌速度、提取時間、提取溫度等6個因素進行考察，研究各因素對甾醇收率的影響。每個實驗均重復2次，結果取平均值，其余亦同。

響應面優化設計：依據單因素考察結果，選擇影響較顯著的4個因素為自變量，以收率為響應值，采用Box-Behnken設計進行四因素三水平實驗，完整的實驗設計由29個實驗點(包括中心點的5個重復實驗)組成，實驗隨機進行，得到的實驗數據用二次非線性多項式模型進行擬合，并且得到回歸系數。

(3)

1.2.5 統計及分析方法

采用Design-Expert 8.0.6.1程序將自變量組合和響應值進行非線性多項回歸和分析。采用決定系數R2評價所得多項式模型的回歸質量；采用F檢驗和P值判斷回歸系數的顯著性，當P<0.05時，差異顯著。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 物料類型對收率的影響

從固體物料中提取天然成分的過程實質是固液萃取，即用萃取劑將溶質從固體物料中萃取出來。因此固體的尺寸會對傳質的速度和提取效果有影響；考慮到溶質具有極性、提取效果和安全性，萃取劑選用乙醇。無水乙醇、液料比20.0 mL/g、攪拌速率150 r/min、提取溫度70.0 ℃、提取時間1.0 h、提取1次，比較了整個豆莢、分成幾塊的碎塊和粉碎成約5 mm左右的小顆粒等原料尺寸對甾醇提取收率的影響，物料類型對甾醇收率的影響如圖1所示。大豆莢甾醇的收率隨著尺寸的減小而增加，這是因為物料尺寸越小，物料和溶劑的接觸面積越大，傳質距離更短，傳質速度也越快，在相同時間內所獲得的提取物會越多；但顆粒太細會導致體系物料結團或成糊、堵塞溶質溶出通道導致收率反而有所降低[14]，體系也不易分離。因此確定甾醇提取的合適物料為5 mm左右的小顆粒。

圖1 物料類型對甾醇收率的影響

2.1.2 液料比對收率的影響

小顆粒、無水乙醇、150 r/min攪拌、提取時間1.0 h、提取溫度70.0 ℃、提取1次，研究了液料比對甾醇收率的影響，液料比對甾醇收率的影響如圖2所示，趨勢與前人報道的一致[11, 14, 15]。從圖2可以看到甾醇收率先隨液料比的增加而提升，這是因為從豆莢中提取甾醇是一個傳質過程，其傳質速度受體系和推動力的影響，隨著液料比的增加，溶液中的甾醇質量濃度被稀釋降低，從而增加了固相與液相間甾醇的質量濃度差，使傳質推動力加大[14, 15]，加快了傳遞速率；同時溶液濃度低，黏度小，傳質阻力??；這使得提取相同的時間能提出更多的甾醇；在液料比25.0 mL/g時甾醇收率最大，隨后收率反而有所減小，導致這種結果的原因可能是提取劑量過大后，雖使提取速度加快了，但提出的甾醇在液相中受溫度的影響時間變長，會有部分降解，再加上液量增大使后續操作時間延長，也會導致損失增加；另外液料比增大會使提取劑成本、能耗增加，所以在提取甾醇時取合適的液料比為25.0 mL/g。

圖2 液料比、乙醇體積分數、攪拌速度、提取溫度及提取時間對甾醇收率的影響

2.1.3 乙醇體積分數對收率的影響

小顆粒、液料比25.0 mL/g、150 r/min攪拌、提取時間1.0 h、提取溫度70.0 ℃、提取1次，考察了乙醇體積分數對甾醇提取收率的影響，乙醇體積分數對甾醇收率的影響如圖2所示，趨勢與前人研究相類似[16]。圖2的結果表明甾醇收率先隨著乙醇體積分數的增加而增加，后在70.0%后收率逐漸減小?？赡芤驗殓薮际橇u基類化合物，羥基具有活性，能與水和乙醇形成氫鍵，其對甾醇在水及有機溶劑中的溶解度有影響，而體積分數為70.0%時極性合適，過高反而會影響其結合，且乙醇揮發性增大[16]。因此在提取甾醇時乙醇的體積分數為70.0%。

2.1.4 攪拌速度對收率的影響

小顆粒、乙醇體積分數70.0%、液料比25.0 mL/g、提取溫度70.0℃、提取時間1.0 h、提取1次，考察了攪拌速度對甾醇提取收率的影響，攪拌速度對甾醇收率的影響如圖2所示。甾醇收率先隨攪拌速度增大而增大，150 r/min后，收率有所減小，其原因是攪拌提高了傳質系數，使物質傳遞和擴散速度增大[17]，但在總時間不變的情況下，過快會使得提取到溶劑中的甾醇受到更長時間的熱分解，從而使收率有所下降。因此確定甾醇提取合適的攪拌速度為150 r/min。

2.1.5 提取溫度對收率的影響

小顆粒、乙醇體積分數70.0%、液料比25.0 mL/g、攪拌速率150 r/min、提取時間1.0 h、提取1次，考察了提取溫度對甾醇提取收率的影響，提取溫度對多糖收率的影響如圖2所示。甾醇收率先隨提取溫度升高而提升，到70.0 ℃收率出現最大值；之后，收率隨溫度升高而有所變小，趨勢與文獻報道的類似[18]。熱處理是有效降低致密的植物組織連接及破解植物細胞的方法之一，它能有效地使細胞破壁，讓有效物質從細胞中擴散出來變得更容易；同時隨著溶液體系溫度的升高，加快了溶質分子的熱運動，提高了其擴散系數，同時降低了溶液的黏度，減少了傳質的阻力，雙重因素促進傳質系數的提高，進而加快了傳質速率，在相同的提取時間里增加了甾醇的提取量。但反過來，過高的溫度會使甾醇分解變性而降低收率[18]，因此確定甾醇合適的提取溫度為70.0 ℃。

2.1.6 提取時間對收率的影響

小顆粒、乙醇體積分數70.0%、液料比25.0 mL/g、攪拌速率150 r/min、提取溫度70.0℃、提取1次，考察了提取時間對甾醇提取收率的影響，提取時間對甾醇收率的影響如圖2所示。甾醇收率先隨提取時間的延長而有較大提升，后隨時間再延長反而降低，趨勢與文獻報道的類似[17, 18]。對固液萃取傳質，溶劑滲入豆莢細胞組織、細胞的破壁及甾醇借助溶劑從物料內傳遞到溶劑中這整個傳質過程需要一定的時間。因此隨提取時間延長，甾醇盡可能多地被提取，使收率提高；但時間過長，會由于物料中的甾醇已基本被提取出，不會使收率增加，反而會使已經提取到液相中的甾醇在體系中受較高溫度的影響發生變性、降解，或者分解的比提取的多，表現出收率降低[17, 18]，所以確定合適的提取時間為1.5 h。

2.2 響應面法優化提取工藝

2.2.1 實驗設計與結果

單因素實驗結果表明，提取的合適條件是小顆粒、乙醇體積分數70.0%、液料比25.0 mL/g、攪拌速率150 r/min、提取溫度70.0 ℃、提取時間1.5 h、提取1次。經顯著性分析發現液料比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度四因素對甾醇提取收率影響極顯著(P<0.001)，故在優化實驗中選擇這四因素為自變量，以所得的各因素最佳水平為中心，以甾醇收率為響應值Y(mg/g)，采用四因素三水平的Box-Behnken實驗設計響應面法，進一步來優化提取條件和獲取最高收率。實驗設計和所得結果列于表1。

2.2.2 模型擬合

將表1導入Design-Expert 8.0.6.1軟件進行處理，得到了應變量與自變量間關系的四元二次多項式方程(式4)。

(4)

2.2.3 模型方差分析

對擬合所得模型進行方差分析，其結果列于表2。由表2中數據可知，模型具有F=116.02、P<0.000 1、R2=0.991 5與Adj.R2=0.982 9，失擬項P>0.05，不顯著，這些數據說明模型與實驗數據間的擬合度較高，用該模型來描述甾醇收率與提取條件組合間的關系是合適的。4個自變量的P值均<0.01，說明對響應值有非常顯著的影響；自變量間的4項交互項與4個自變量的平方項的P值也均<0.01，即對響應值均有非常顯著的影響，說明響應值與自變量間不是簡單的一次關系。

表1 實驗設計與結果

2.2.4 優化值與響應面

運行Design-Expert 8.0.6.1程序，可得到甾醇收率最大的提取條件組合是：液料比25.4 mL/g，乙醇體積分數73.5%，提取時間1.6 h，提取溫度71.3 ℃，在此條件下，豆莢甾醇理論收率為3.12 mg/g。不同因素組合對甾醇收率的影響見圖3。圖中若某個自變量立面上的邊線平坦則該說明該自變量對響應值(收率)的影響弱，邊線陡則影響強；等高線圖形接近圓形則該兩個自變量之間交互影響小，接近橢圓形則交互影響強[19]；等高線稀疏則影響小，等高線密集則影響顯著[18]。由圖3可見，各自變量組合的圖形曲面均開口朝下，各自變量對響應值的關系線呈拋物線，響應值的極值均出現在實驗范圍內；等高線呈現橢圓形，說明自變量兩兩之間有交互影響，對響應值有影響；等高線疏密不一，比較可得自變量對響應值的影響強弱排序是：液料比>提取溫度>提取時間>乙醇體積分數，這與單因素考察的結果相吻合。

圖3不同因素組合對甾醇收率的影響

表2 回歸模型方差分析

2.2.5 驗證實驗

為驗證RSM法得到的結果是否可靠，在模型所得的最優提取條件組合—液料比25.4 mL/g、乙醇體積分數73.5%、提取時間1.6 h、提取溫度71.3 ℃、小顆粒原料、攪拌速度150 r/min提取1次條件下，進行3次平行甾醇提取實驗(n=3，RSD=6.1)，測得甾醇實際收率的平均值為3.08 mg/g，與模型所預測的3.12 mg/g收率理論值相吻合，說明所得結果可靠。

3 結論

研究了用乙醇溶液從老大豆莢中提取甾醇的工藝，結果表明所考察的因素對甾醇收率均有較明顯的影響；旨在使甾醇收率最大化而進行的四因素三水平的響應面法優化提取工藝實驗，得到了最優提取條件組合：液料比25.4 mL/g、乙醇體積分數73.5%、提取時間1.6 h、提取溫度71.3 ℃，其他是小顆粒原料、攪拌速度150 r/min、提取1次；在該組合條件下，模型預測的甾醇最高理論收率可達3.12 mg/g，實驗所得甾醇實際收率為3.08 mg/g，兩者相吻合，說明所得模型合理；響應面曲面圖、等高線及方差分析結果說明，各因素對甾醇收率有顯著的影響。