投飼頻率對青魚生長、生理生化指標及攝食相關基因表達水平的影響

潘偉平 王伊凡 應李民 簡杰亮 楊繼成 葉金云 明建華

(湖州師范學院，湖州 313000)

在集約化和規模化的水產養殖中，主要通過投喂人工配合飼料來養殖水產動物，其中飼料投飼頻率是影響魚類生長及飼料效率的重要因素之一[1]。有關魚類投喂頻率的研究表明，適宜的投喂頻率可以增加魚類的生長速度和存活率，縮小體型差異，改善攝食轉換率，提高終產量；而不合理的投喂頻率不僅導致魚體參差不齊，還會造成飼料浪費，增加養殖成本，并污染養殖環境[2-4]。因此，確定適宜的投飼頻率對提高青魚養殖的經濟和生態效益具有重要意義。

目前，有關黃顙魚(Pelteobaggrusvachelli)幼魚[5]、星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚[6]等魚類的研究表明，適宜的投飼頻率可改善幼魚的攝食量并增加生長速度；而對鯉魚(Cyprinuscarpio)、長吻鮠(Leiocassislongirostris)的研究表明，適宜的投飼頻率可降低循環養殖系統水體氨氮類有毒有害物質的含量，改善水質，提高魚類的存活率[7]。青魚(MylopharyngodonpiceusRichardson)是我國傳統淡水養殖的“四大家魚”之一，據《2019中國漁業統計年鑒》報道[8]，我國青魚養殖年產量為69.13萬t，而目前有關投飼頻率對青魚相關影響的研究仍鮮見報道。因此，本試驗以青魚為研究對象，探討不同投飼頻率對青魚幼魚生長、生理生化指標以及攝食相關基因表達水平的影響，以便獲得青魚幼魚生長速度最快和飼料轉化率最佳的投飼頻率，為青魚的集約化養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗青魚及放養

青魚幼魚購于湖州市吳興豐溢現代水產養殖場。試驗選擇450尾體質健壯，規格基本一致的青魚幼魚，初始體質量(12.29±0.40)g，隨機分成5組，每組設3個重復，每個重復30尾魚，飼養于本實驗室室內循環水養殖系統的15個養殖桶中。每桶水容積450 L，控制水流速為1.6 L/min，并通過氣石持續充氣增氧。

1.2 飼料制備與投喂

試驗飼料組成及營養水平見表1，各種原料分別粉碎過60目篩，采用逐級擴大法添加微量成分，使各組分充分混勻后，用小型飼料造粒機制成粒徑2 mm的沉性顆粒飼料，40 ℃烘干后于4 ℃冰柜中保存備用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)

注：a表示購于企業；b為實測值。

飼養試驗中，前期馴化7 d，后期正式飼養60 d。采用人工投飼，日投飼量按魚體質量的2～5%來計算，并控制在30 min內無剩餌為宜，即表觀飽食。投飼頻率如下：(1)投喂1次/2 d，投喂時間為8:00；(2)投喂1次/d，投喂時間為8:00；(3)投喂2次/d，投喂時間為8:00、17:00；(4)投喂3次/d，投喂時間為8:00、12:30、17:00；(5)投喂4次/d，投喂時間為8:00、11:00、14:00、17:00。飼養期間水溫為26～29 ℃，pH為7.2～7.8，溶解氧>6 mg/L，氨氮<0.01 mg/L。

1.3 采樣與處理

正式飼養60 d后采樣，采樣前禁食24 h，將各桶魚稱重、計數，然后每桶隨機選取3尾體重相近的青魚，用濃度為100 mg/L的MS-222作快速深度麻醉，經稱重和量體長后用一次性醫用注射器從尾靜脈采血。血樣在4 ℃冰箱中靜置1～2 h后，以4 ℃ 3 000 r/min離心10 min制備血清，-20 ℃凍存備用。

魚體采血后立即剖開腹腔，剝離出內臟和肝胰臟并稱重，取適量肝臟和腸道用于常規分析；取部分背鰭下方側線以上的背部肌肉用于肌肉成分分析；取適量腦組織，用于攝食相關基因的表達分析，均以-80 ℃保存。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長與形體指標

分別按下式計算增重率(WG)、特定生長率(SGR)、攝食率(FR)、飼料系數(FCR)、存活率(S)、肝體指數(HSI)、臟體指數(VSI)、肥滿度(CF)：

增重率(WG，%) = 100× (Wt-W0) /W0

特定生長率(SGR，%/d) = 100×(lnWt- lnW0) / t

攝食率(FR，%/d) = 100×FI/ [t×(Wt+W0)/2]

飼料系數(FCR) =FI/ (Wt-W0)

存活率(S，%) = 100 ×Nt/N0

肝體指數(HIS，%) = 100×Wh/Wb

臟體指數(VSI，%) = 100×Wv/Wb

式中：W0為魚初體質量/g；Wt為魚末體質量/g；t為飼喂天數/ d；FI每尾魚平均攝食飼料總質量(風干樣重)/g；N0為初魚尾數；Nt末魚尾數；Wh為每尾魚末肝臟質量/g；Wv為每尾魚末內臟質量/g；Wb為每尾魚末體質量/g；L為每尾魚末體長/cm。

1.4.2 肌肉成分分析

水分采用105 ℃恒重法(GB 6435—1986)測定；粗蛋白質含量采用微量凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)測定；粗灰分含量采用550 ℃灼燒法(GB/T 6438—1992)測定。

1.4.3 血清生化指標的測定

超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)的活性等用南京建成生物工程研究所試劑盒，按照說明書進行測定。

1.4.4 肝臟抗氧化相關指標的測定

肝臟樣品解凍后，用冷生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，肝臟樣品與勻漿介質(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液)按1∶9 (W∶V)的比例冰浴勻漿，然后4 ℃ 3 800 r/min離心10 min，取上清液用于分析。該待測液的蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法進行測定。SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的水平等按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行測定。

1.4.5 腸道消化酶活性的測定

試驗采用田間小區法。2016年設上年秋季（10月中旬）覆膜、當年早春（4月初）覆膜兩個非生育期覆膜處理和常規播前（4月下旬）覆膜為對照。小區面積242 m2，小區寬11 m，小區長22 m，3次重復，隨機排列。專用機械覆膜，采用170 cm寬的黑色地膜。

測定前將腸組織樣品取出，在室溫下自然解凍，剔除脂肪和消化道內含物。取全腸稱重，然后加入9倍冷卻的磷酸緩沖液(4 ℃，pH7.3)，冰浴勻漿(8 000 r/min，5 s/次，間隔10 s，連續4～5次)，取上清液置于4 ℃冰箱中待測(不超過24 h)。檢測腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的試劑盒購于南京建成生物工程研究所，按照說明書進行測定。

1.4.6 腦組織攝食相關基因的表達分析

使用組織/細胞RNA快速提取試劑盒(Aidlab，中國)抽提青魚腦組織總RNA，具體操作按試劑盒說明書進行，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，同時用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific，美國)核酸蛋白測定儀檢測RNA的純度和濃度，RNA樣品應具有清晰完整的條帶、OD260/OD280為1.8～2.0。用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)將總RNA反轉錄合成cDNA，并于-20 ℃保存備用。

根據GenBank上青魚腦組織攝食相關基因神經肽Y(Neuropeptide Y, NPY)和腦腸肽(Ghrelin, GRL)的核苷酸序列，利用Primer 5.0設計上述基因及管家基因β-肌動蛋白(β-actin)的特異性引物，引物序列見表2。所有引物均由上海英濰捷基(Invitrogen)公司合成。

1.5 數據處理與分析

實驗數據用SPSS 16.0統計軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。實驗結果以平均值±標準差(Means±SD)表示。

表2 實時定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 投飼頻率對青魚生長性能的影響

由表3可知，投飼3次/d的青魚幼魚增重率、特定生長率和攝食率顯著高于1、2次/d和1次/2d組(P<0.05)，而投飼3、4次/d之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼4次/d的飼料系數顯著高于1次/2 d和1次/d(P<0.05)，而與其余各組之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼3、4次/d組的青魚存活率顯著高于1次/2d組(P<0.05)，而其余各組間的差異不顯著(P>0.05)；投飼頻率對青魚幼魚的肝體指數、臟體指數與肥滿度無顯著影響(P>0.05)。由此可見，青魚幼魚每天投喂3次可顯著提高其增重率、特定生長率、攝食率和存活率，促進青魚幼魚的生長。

表3 投飼頻率對青魚生長及形體指標的影響

注：3個重復的平均值±標準差(SD)；9個樣本的平均值±SD；同行數據中有不同上標字母者表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

表4 投飼頻率對青魚肌肉成分的影響/%

注：表中值為9個樣本的平均值±SD；同一行數據中有不同上標字母者表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

表5 投飼頻率對青魚血清生化指標的影響

表6 投飼頻率對青魚肝臟抗氧化相關指標的影響

2.2 投飼頻率對青魚肌肉成分的影響

由表4可知，青魚幼魚肌肉粗脂肪的含量隨投飼頻率的增加而升高，與投飼1次/2 d相比，投飼4次/d可顯著提高青魚肌肉中粗脂肪的水平(P<0.05)，但投飼頻率對青魚幼魚肌肉的水分、粗蛋白和灰分無顯著影響(P>0.05)。

2.3 投飼頻率對青魚血清生化指標的影響

由表5可知，隨著投飼頻率的增加，血清中超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)和堿性磷酸酶(AKP)的活性呈升高的變化趨勢，而谷丙轉氨酶(GPT)呈下降的變化趨勢(P<0.05)，但對谷草轉氨酶(GOT)的活性無顯著影響(P>0.05)。投飼3次/d的超氧化物歧化酶活性顯著高于1、2次/d與1次/2 d組(P<0.05)，而3次/d與4次/d之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼3、4次/d的溶菌酶活性顯著高于1次/2 d組的水平(P<0.05)，而與其他各組間的差異不顯著(P>0.05)；投飼2～4次/d的堿性磷酸酶活性顯著高于1次/d、1次/2 d組(P<0.05)，而投飼2～ 4次/d組之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼1次/2 d的GPT活性顯著高于2～4次/d組(P<0.05)，而投飼2～4次/d組之間的差異不顯著(P>0.05)。結果表明，青魚幼魚每天投飼3次，可增強其非特異性免疫力。

2.4 投飼頻率對青魚肝臟抗氧化相關指標的影響

由表6可知，隨著投飼頻率的增加，青魚肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性呈上升的變化趨勢，而丙二醛含量呈現下降的變化趨勢。投飼3、4次/d的SOD活性顯著高于1次/2 d組(P<0.05)；投飼3次/d的谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于1次/d和1次/2 d的水平(P<0.05)；投飼2～ 4次/d組的過氧化氫酶的活性顯著高于1次/d和1次/2 d的水平(P<0.05)；投飼3、4次/d組的丙二醛含量顯著低于1次/d和1次/2 d的含量(P<0.05)。這表明青魚幼魚每天投飼3次，可增強其抗氧化能力。

2.5 投飼頻率對青魚腸道消化酶活性的影響

由表7可知，隨著投飼頻率的增加，腸道胰蛋白酶和脂肪酶的活性均呈下降的變化趨勢，而淀粉酶的活性呈升高的變化趨勢。投飼1次/2 d與1次/d組中胰蛋白酶活性顯著高于2～4次/d組的活性(P<0.05)；投飼1次/2 d組中脂肪酶活性顯著高于4次/d組(P<0.05)，而與其余各組間的差異不顯著(P>0.05)。投飼2～4次/d組中淀粉酶的活性顯著高于1次/d和1次/2 d組的水平(P<0.05)。由此可見，投飼3、4次/d可降低腸道胰蛋白酶和脂肪酶的活性，而增加淀粉酶的活性。

表7 投飼頻率對青魚腸道消化酶活性的影響

2.6 投飼頻率對青魚攝食相關基因表達的影響

由圖1可知，隨著投飼頻率的增加，青魚腦神經肽Y(NPY)mRNA表達水平呈升高的變化趨勢。投飼3、4次/d組的NPY相對表達水平顯著高于投飼1次/2 d和1次/d組的水平(P<0.05)，而二者之間的表達水平無顯著差異(P>0.05)。

注：柱上不同字母表示同一基因在不同投飼頻率下表達水平的差異顯著(P< 0.05)，下同。圖1 投飼頻率對青魚腦神經肽Y mRNA表達水平的影響

由圖2可知，隨著投飼頻率的增加，青魚腦腸肽(GRL)表達水平呈升高的變化趨勢。投飼3、4次/d組腦腸肽的表達水平顯著高于投飼1次/2 d、1次/d組的水平(P<0.05)，但這兩組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 投飼頻率對青魚腦腸肽mRNA表達水平的影響

3 討論

3.1 投飼頻率對青魚生長的影響

研究表明，在適宜范圍內，增加投飼頻率可顯著影響養殖魚類的增重率、存活率和飼料利用效率[2-4]。在本試驗中，投飼頻率為3、4次/d時，青魚幼魚的增重率、特定生長率、攝食率和存活率均顯著提高，但飼料系數也顯著提高。這與投喂頻率對大黃魚(Pseudosciaenacrocea)生長性能的影響的是一致的[10]。以前也有相關的研究報道，雜交魴幼魚投飼頻率從0.5次/d增加至3次/d時的相應增重率顯著提高[11]，但飼料系數顯著下降，這與本研究不一致；南方鲇(Silurusmeridionalis)特定生長率也隨投飼頻率的增加而顯著提高，但飼料轉化率不受投飼頻率的影響[12]；樓寶等[13]發現，投飼頻率影響黑鯛的生長是由飼料轉化率的改變引起的，適宜投飼頻率隨著黑鯛魚體重的增加而提高，黑鯛魚種的適宜飼喂頻率為2次/d，黑鯛成魚的適宜飼喂頻率為4次/d。本試驗中，隨著投飼頻率的增加提高了攝食率，促進了青魚幼魚的生長，但飼料系數也顯著升高，由此可見，投飼頻率對青魚幼魚生長的影響并非是因為提高了飼料轉化率，而攝食率的提高可能才是投飼頻率影響青魚生長的主要因素[12]。

在本試驗中，投飼頻率對青魚幼魚的肝體指數、臟體指數和肥滿度等形體指標均沒有顯著影響。崔超等[14]報道，不同投飼頻率對俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii)幼魚的肝體指數和臟體指數沒有顯著影響，但投飼3、4次/d的肥滿度顯著高于投飼2、6次/d的水平；但紀文秀[15]研究表明，投飼頻率對點帶石斑魚(Epinephelusmalabaricus)的肥滿度沒有顯著影響。

在本研究中，隨著投飼頻率增加，青魚的增重率與飼料系數均有所提高，但4次/d組相對3次/d組的增重率不顯著，但飼料系數反而增加，此時其攝食量較高而飼料轉化效率較低，造成飼料的浪費。這說明在一定范圍內，增加投飼頻率有助于青魚的生長，但過高的投飼頻率效果反而較差。這與崔超等[14]、紀文秀[15]、林艷[16]等的實驗結果一致。

3.2 投飼頻率對青魚肌肉成分、生理生化指標的影響

投飼頻率的增加使魚類攝食率也增加，而過多的營養物質會形成脂肪儲積，魚類體重增加往往伴隨著體成分的改變，如脂肪含量增加[17]。在本試驗中，與投飼1次/2d相比，投飼4次/d可顯著提高青魚肌肉粗脂肪的水平，而其他成分無顯著變化。邱婷婷等[11]對雜交魴的研究中也發現，青魚肌肉粗脂肪含量受投飼頻率的影響較大，當投飼頻率由1次/2 d上升到4次/d時脂肪含量明顯增加，反映了魚體內營養的積蓄量。本實驗結果也與在南方鲇[12]、鱸魚[18](Lateolabraxjaponicus)、大黃魚[19](Pseudosciaenacrocea)中的報道類似。而在星斑川鰈[6]的研究中，隨著投飼頻率增加，肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量均有所提高，可能與星斑川鰈饑餓時主要利用脂肪而青魚還可適當利用糖類有關[20]，吸收利用的飼料糖類可部分以體脂的形式儲存于魚體內[17]。

超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)是魚類非特異性免疫的重要因子，在機體免疫防御中發揮重要作用[21]。溶菌酶是生物體內重要的非特異性免疫因子之一，它產生于嗜中性粒細胞和巨噬細胞，并被分泌到血液及粘液中發揮溶菌效應，研究表明機體溶菌酶活性提高，其免疫力也相應提高[22]。本試驗中，投飼3、4次/d顯著提高了青魚血清SOD、AKP以及溶菌酶的活性。林艷等[16]研究表明，投飼3、5次/d也可提高團頭魴(Megalobramaamblycephala)血漿堿性磷酸酶活性。Li等[23]報道，投飼3次/d可顯著提高團頭魴攻毒后血漿溶菌酶的活性。

動物機體在新陳代謝的過程中，活性氧自由基(ROS)的產生和消除保持著動態平衡，過多的自由基會引起脂質過氧化反應，丙二醛(MDA)是脂質過氧化物的主要成分，具有很強的生物毒性，會破壞細胞的結構和功能[24]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)等組成的抗氧化酶系統可清除過多的自由基，減少脂質的過氧化損傷[25]。本研究中，投飼3、4次/d可顯著提高青魚幼魚肝臟SOD、GPx和CAT的活性，增強魚體的抗氧化能力。以前也有類似的報道，投飼5、6次/d可顯著提高團頭魴肝臟GPx和CAT的活性，降低肝臟MDA的水平[23]；投飼6次/d也可顯著提高日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)肝胰腺SOD、GPx和CAT的活性[26]。

3.3 投飼頻率對青魚腸道消化酶活性的影響

不同動物的生態習性和攝食對象不同，其相應的消化酶的性質也會有所變化[27]。青魚為肉食性無胃魚類，主要消化部位中腸道蛋白酶的活性相對較高，青魚通過改變消化道內各種酶的活性，達到積極利用營養物質[28]。研究表明，提高投飼頻率(8次/d)可改善大黃魚幼體腸道消化酶的活性[19]；投飼頻率對瓦氏黃顙魚肝胰腺中的蛋白酶活性無顯著影響，而腸中蛋白酶活性則隨投飼頻率增加而顯著降低[5]；投飼頻率對俄羅斯鱘幼魚肝臟中胰蛋白酶的活性無顯著影響，但其淀粉酶和脂肪酶活性隨投飼頻率的增加而升高[14]。在本實驗中，隨著投飼頻率的增加，青魚腸道胰蛋白酶和脂肪酶活性呈下降的變化趨勢，而淀粉酶活性呈升高的變化趨勢。這可能在于減少投飼次數，導致適當的饑餓，有利于促進青魚對飼料營養成分的消化吸收[5]。

3.4 投飼頻率對青魚腦攝食相關基因表達的影響

神經肽(NPY)和腦腸肽(GRL)是重要的攝食調節因子，均可促進動物的攝食，并調控生長激素的分泌，促進生長。馬冠奎[29]研究發現，向斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)腹部注射NPY可以促進魚體自身NPY及生長激素mRNA的表達。De等[30]向金魚體內注射微量NPY，也可有效促進金魚的攝食行為。倪靜[31]對中華倒刺鲃(Barbodessinensis)的研究亦發現，促攝食物質的強度與腦NPY的表達量呈正比。NPY能提高脂肪組織中脂蛋白脂肪酶和乙酰輔酶A羧化酶的活性，促進脂肪生成，引起體重增加，還能抑制動物褐色脂肪中交感神經的興奮性，從而使產熱和耗能都減少。GRL是一種具有食欲促進作用的消化道分泌激素，廣泛參與生物體內多種生理功能，包括促進攝食、生長激素的釋放等[32]。在本研究中，隨著投飼頻率的增加，青魚幼魚腦中NPY和GRL的表達水平均呈升高的變化趨勢，投飼3、4次/d的青魚腦NPY和GRL的表達水平較高，有助于促進青魚的生長。

4 結論

投飼3次/d可提高青魚幼魚的攝食率和存活率，促進青魚的生長，增強魚體的非特異性免疫力和抗氧化能力，提高攝食相關基因的表達水平，因此青魚幼魚的適宜投喂頻率為3次/d。