超聲波提取馬藺籽油的脂肪酸組成及其抗氧化能力評價

欒真杰 李佩佩 皮 立 李 朵 孟曉萍 孫 菁

(青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室；中國科學院西北高原生物研究所 1，西寧 810008) (中國科學院大學2，北京 100049)

馬藺植物[IrislacteaPall.var.chinensis(Fisch.) Koidz.][1]為我國的廣布種，在20個省均有分布，具有較大的野生資源量。其成熟果實為馬藺籽，又名蠡實，收錄于《本草綱目》草部，主治寒疝諸疾、喉痹等癥。蒙藏醫理論認為，馬藺籽主治胃痙攣、燙傷、闌尾炎、身目發黃等癥[2，3]，具有較高的藥用價值。通過對馬藺籽的顯微特征進行研究，發現馬藺種仁部分含有大量油細胞[4]，其含油量在3%～12%，經藥理實驗證明對小鼠無毒，主要含有亞油酸及油酸[5,6]，這些活性成分具有抗菌、降低血清膽固醇、預防和治療高血壓及動脈粥樣硬化癥、冠心病等作用[7-9]。

目前，對馬藺籽的研究主要集中于種皮部位，尤其是自馬藺籽種皮中提取的馬藺子素及其相關制劑已收載于我國新藥轉正標準。而占比較大的種仁部分則相對研究較少，利用程度低，造成了大量的資源浪費。因此，有必要對其馬藺籽油進行深入研究。本研究以馬藺籽為原料，在單因素實驗的基礎上采用響應面法優化馬藺籽油超聲提取工藝條件；用氣相色譜-質譜聯用法分析馬藺籽油中的脂肪酸組成及相對含量；同時結合DPPH自由基清除法和還原鐵/抗氧化能力法對其抗氧化活性進行研究，以期為馬藺籽資源的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬藺籽購自藥材市場，經中國科學院西北高原研究所盧學峰研究員鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物馬藺[IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.]的干燥成熟果實，所購種子顆粒飽滿、無霉變，存放于中國科學院西北高原生物研究所。石油醚(60～90 ℃)、氫氧化鉀、甲醇、三氟化硼等均為分析純。

總抗氧化能力(T-AOC)測試盒(A015-2 ABTS快速法 100T)、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒(A015-3 FRAP法 100T)、DPPH、抗壞血酸。

1.2 主要儀器

Thermo 1300/8000Evo氣相色譜-質譜聯用儀；Eppendorf 5810R離心機；Epoch2微孔板分光光度計；HH-6型數顯恒溫水浴鍋；N-1100旋轉蒸發儀；電熱鼓風干燥箱；SHB-Ⅲ循環水真空泵；KQ5200DE型數控超聲波清洗器；YB-700多功能粉碎機；ZFJ-200中草藥粉碎機。

1.3 馬藺籽油超聲提取條件優化

1.3.1 原料預處理

篩除馬藺籽中的碎殼、殘葉等雜質，然后將馬藺籽置于50 ℃烘箱中烘干至恒重。用多功能粉碎機碎皮后過20目篩，除去馬藺籽種皮，得到馬藺籽種仁。將種仁用粉碎機粉碎后過40目篩，裝于自封袋中4 ℃冷藏備用。

1.3.2 提取工藝流程

馬藺籽→除雜→烘干→脫去種皮→粉碎→過篩→超聲提取→離心→減壓蒸餾→干燥→馬藺籽油→稱重。

稱取馬藺籽種仁粉10.00 g，以石油醚為溶劑，在一定條件下進行超聲提取，離心得到石油醚提取液，40 ℃條件下旋蒸，除盡溶劑，置于電熱鼓風干燥箱中干燥至恒重，得馬藺籽油，稱重，按照公式計算馬藺籽油得率[10]。

式中:m為馬藺籽的質量/g，m2為空瓶質量；m1為空瓶和馬藺籽油的質量。

1.3.3 響應面優化實驗設計

單因素實驗：按照1.3.2中的超聲提取方法，超聲溫度30 ℃、超聲功率200 W、液料比9 mL/g，考察超聲時間(10、20、30、40、50、60、70 min)對出油率的影響；超聲時間30 min、超聲功率200 W、液料比9 mL/g，考察超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)對出油率的影響；超聲溫度30 ℃、超聲功率200 W、超聲時間30 min，考察液料比(3、6、9、12、15、18 mL/g)對出油率的影響。

響應面實驗：根據超聲處理溫度、時間、功率及液料比四個單因素實驗結果，篩選對馬藺籽油得率較為顯著的因素作為考察目標，確定響應面實驗因素水平。以馬藺籽油得率為響應值，用Design-Expert軟件，選用Box-Behnken方法隨超聲提取工藝進行優化。

1.4 馬藺籽油脂肪酸組成分析

1.4.1 馬藺籽油的甲酯化

參照GB 5009.168—2016的方法，稱取馬藺籽油0.1 g于100 mL平底燒瓶中，加入8 mL 2%氫氧化鉀—甲醇溶液，在80 ℃水浴上回流直至油滴消失，從回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，繼續回流2 min，冷卻至室溫，準確加入10 mL正庚烷振搖2 min，再加入飽和氯化鈉溶液振搖靜置分層，吸取上層正庚烷提取液5 mL于試管中，加入約3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。

1.4.2 GC-MS條件

用GC-MS法對馬藺籽油脂肪酸成分進行分析，采用面積歸一化法處理數據，并通過檢索Nist14數據庫和人工解譜的方法，分析圖譜中的主要成分。

分析條件：毛細管色譜柱為安捷倫DB-FFPA柱(100 m×0.25 mm ID，0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；載氣為氦氣；進樣量1 μL；分流比20∶1；程序升溫50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升溫至175 ℃，再以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；電離方式為電子轟擊離子源(EI)；柱頭壓力230 kPa；傳輸線溫度280 ℃。

1.5 馬藺籽油抗氧化能力測定

1.5.1 DPPH·清除能力測定

參考Ardestani等[11，12]的方法分別取不同質量濃度的馬藺籽油溶液2 mL，各加入0.2 mmol/mL的DPPH-乙醇溶液2 mL，混合均勻，于常溫下避光反應30 min，517 nm波長處測吸光度(As)，以無水乙醇為空白對照(Ab)，以VC為陽性對照，按公式計算DPPH的清除率。

根據不同質量濃度馬藺籽油的清除率，結合SPSS 25.0數據處理軟件，計算出對DPPH自由基清除率為50%時所需的溶液質量濃度(IC50)，以IC50值表示馬藺籽油清除DPPH自由基的能力，IC50值越小，表示清除能力越強。

1.5.2 FRAP法測定抗氧化活性

按照總抗氧化能力檢測試劑盒(A015-3 FRAP法)說明書制備工作液，37 ℃水浴30 min，依次加入空白對照水和不同濃度的馬藺籽油溶液，室溫反應6 min，測定反應液在593 nm處的吸光度，每個樣品重復3次。

以FeSO4·7H2O為標準物質，分別配制濃度為0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L的溶液，以標準品OD值為橫坐標，各OD值對應的標準品濃度為縱坐標，制成標準曲線，將樣品OD值代入，計算提取后的溶液與某個摩爾濃度標準品FeSO4抑制率相同，用該濃度下FeSO4的摩爾濃度表示。

1.6 統計方法及分析軟件

所有指標均重復測定3次并求取平均值，用Origin 2018軟件作圖；用SPSS 25.0進行數據統計分析；響應面分析用Design-Expert 11軟件進行。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化結果

2.1.1 單因素實驗結果

預實驗中發現，超聲功率為100～500 W時，其對馬藺籽油得率有一定影響，但沒有顯著性(P>0.05)差異，因此，單因素實驗固定超聲功率為200 W。圖1為不同單因素對馬藺籽油得率的影響。

超聲時間的影響：由圖1可以看出，在10～50 min時，馬藺籽油得率隨提取時間的延長不斷提高，且增長速度很快，而在50～70 min時，馬藺籽油得率略有下降。可能由于超聲波具有強烈的壓力、剪切力和溫度梯度，長時間的超聲會破壞油脂分子結構[13]，導致籽油得率下降。綜合考慮，選擇提取時間30～70 min進行響應面實驗。

超聲溫度的影響：由圖1可知，當提取溫度在30～50 ℃時，馬藺籽油得率隨著提取溫度的升高迅速增大，可能是溫度的升高增加了溶劑分子和油脂分子的動能而有利于油脂分子的擴散；但是當提取溫度在50～70 ℃時，馬藺籽油得率卻顯著下降。可能是因為當溫度達到石油醚沸程時石油醚在超聲的環境中揮發速度過快，造成其液料比降低，難以充分提取馬藺籽油[14]，并且可能帶走部分已經溶解的籽油，造成其得率有所下降。因此選擇30～70 ℃進行響應面實驗。

液料比的影響：通常情況下，較大的溶劑體積由于擁有更高的濃度差，可以更有效地溶解成分，從而提高提取產率[15]。由圖1可見，馬藺籽油得率在液料比為3～9 mL/g時，隨液料比增加而逐漸增大，當液料比超過9 mL/g時，馬藺籽油得率上升趨勢變緩逐漸趨于平衡。其原因可能是當溶劑量已經充分完成提馬藺籽油的條件時，馬藺籽油得率趨于平衡。綜合考慮，選擇液料比3～15 mL/g進行響應面實驗。

圖1 不同單因素對馬藺籽油得率的影響

2.1.2 響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，確定提取時間、提取溫度和液料比3個因素，以馬藺籽油(Y)為響應值，采用Box-Behnken實驗對馬藺籽油提取工藝進行優化。因素水平見表1，響應面實驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表1 響應面實驗因素水平

表2 響應面實驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

采用 Design-Expert 11數據分析軟件對表2中的實驗結果進行回歸擬合，回歸分析結果見表3。由表3可以看出，在所選取的各因素水平范圍內，A(液料比)、B(超聲時間)、C(超聲溫度)對應的P值均小于0.01，說明這3個因素對馬藺籽油得率的影響極顯著，AB、AC、BC所對應的P值均小于0.01，說明各個因素之間兩兩交互作用明顯。3個因素對馬藺籽油得率的影響順序為提取溫度≈料液比>提取時間。

擬合回歸方程為：Y=9.7+1.41A-0.30B-0.67C+0.38AB+0.36AC-0.36BC-1.05A2-0.22B2+0.11C2。

2.1.3 最佳工藝驗證實驗

經響應面回歸分析得到的最優提取工藝條件為提取時間64.021 min、提取溫度30.000 ℃、液料比12.784 mL/g，在此條件下馬藺籽油得率的理論值達到10.78%。考慮到實際操作，將最佳工藝條件修正為提取時間64 min、提取溫度30 ℃、液料比12 mL/g。在最佳條件下進行5次驗證實驗，馬藺籽油得率均值為10.56%，與理論值相對誤差為1.99%，說明Box-Behnken設計響應面法得到的提取條件相對可靠。

2.2 馬藺籽油脂肪酸組成及含量分析

將所得馬藺籽油甲酯化后，進行GC-MS分析。馬藺籽油主要脂肪酸組成及相對含量見圖2和表4。超聲提取條件下的馬藺籽油主要含有19種脂肪酸成分，其中飽和脂肪酸主要為棕櫚酸(7.75%)及硬脂酸(2.73%)；不飽和脂肪酸主要為亞油酸(41.57%)和油酸(38.96%)。不飽和脂肪酸占比達85%左右。其脂肪酸組成及質量分數與芝麻油極為相似[16]，棕櫚酸7.9%～12.0%；硬脂酸4.5%～6.7%；油酸34.4%～45.5%；亞油酸36.9%～47.9%；亞麻酸0.2%～1.0%；花生酸0.3%～0.7%。含量最高的亞油酸(LA)是功能性多不飽和脂肪酸(PUFA)中被最早認識的一種，是必需脂肪酸(EFA)[8]，具有降低血清膽固醇水平作用，攝入大量亞油酸對高甘油三酯疾病有明顯的療效。我國2015版《藥典》仍采用亞油酸乙酯丸劑、滴劑作為預防和治療高血壓及動脈粥樣硬化癥、冠心病的藥物。此外，亞油酸還是ω-6長鏈多不飽和脂肪酸，尤其是γ-亞麻酸和花生四烯酸的前體[9]。因此，可以考慮將馬藺籽油作為功能性油脂開發利用。

圖2 馬藺籽油脂肪酸總離子流圖

表4 馬藺籽油中主要脂肪酸組成及相對含量

2.3 馬藺籽油的體外抗氧化能力

2.3.1 馬藺籽油清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是一種穩定的自由基，其廣泛用于評估油脂的自由基清除活性[17]。由圖3可知，馬藺籽油有較好的清除DPPH自由基的活性，且清除率隨質量濃度的增加而增大，呈現較好的量效關系。以VC為參照，隨著樣品質量濃度的增加，DPPH·的清除率逐漸增加，在質量濃度達28 mg/mL時，清除率達61.12%。用SPSS 25計算IC50值為20 mg/mL。

圖3 馬藺籽油對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 馬藺籽油的Fe3+還原能力

測定馬藺籽油對Fe3+的還原力，本質是對其供電子能力進行檢驗。理論上，還原力強的物質能更好地提供電子，樣品抗氧化能力的強弱可由其還原能力的大小間接反映出來。由圖4可知，不同質量濃度的馬藺籽油和對Fe3+均具有一定的還原能力，且隨著質量濃度的提高，還原力呈現上升趨勢，當質量濃度達到280 mg/mL時，還原率趨于穩定，為32.28%。

以FeSO4·7H2O吸光度值為橫坐標，對應的濃度為縱坐標，用Origin軟件作出標準曲線為：y=3.162 2x-0.365 5，相關系數r=0.997 0，R2=0.993 9。將樣品OD值代入求得樣品總抗氧化能力為0.251 1 mmol/L FeSO4·7H2O。

圖4 Fe3+的還原能力標準曲線

3 結論

在單因素實驗的基礎上，運用響應面設計的理論與方法，確定了超聲提取馬藺籽油最佳工藝條件為：提取時間64 min、提取溫度30 ℃、提取功率200 W、液料比12 mL/g。在此條件下，馬藺籽油得率為10.56%。響應面分析結果顯示，4個因素對馬藺籽油得率的影響順序為：提取溫度≈液料比>提取時間>提取功率，其中液料比及提取溫度影響達到極顯著水平，提取時間影響達到顯著水平。本結果可以為馬藺籽油的開發利用提供參考和指導。

馬藺籽油中飽和脂肪酸主要為棕櫚酸及硬脂酸；不飽和脂肪酸主要為亞油酸和油酸，不飽和脂肪酸占比81.55%。馬藺籽油具有良好的抗氧化活性，DPPH自由基清除率達61.12%，FRAP法測定其總抗氧化能力為0.251 1 mmol/L FeSO4·7H2O，可以考慮作為功能性油脂產品開發利用。