山茶油中原花青素的提取工藝優化及含量測定

王宗成 路大中 王守敏 鄭輝煌 楊麗華 羅小芳

(湖南科技學院化學與生物工程學院1，永州 425199) (湖南科技學院湖南省生物質資源綜合開發利用工程技術研究中心2，永州 425199)

油茶為我國特有的木本油料樹種，是世界四大木本油料植物之一[1]，同時也是我國四大木本油料植物之一[2]。山茶油為油茶果實中通過壓榨或浸出得到，其含有油酸、亞油酸、生育酚等營養物質，具有預防心血管疾病和降低膽固醇的作用[3-5]。

原花青素是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，也稱縮合單寧。原花青素具有護肝降脂、防治動脈粥樣硬化、抗氧化等藥理學活性[6-8]。同時原花青素具有抗紫外線作用，常用在防曬護膚品中，被西方稱為“口服化妝品”和“皮膚維生素”[9,10]。

目前山茶油的研究主要集中在維生素E、角鯊烯和植物甾醇含量的測定等方面，對其原花青素含量極少報道[11,12]。原花青素能夠清除自由基，明顯增強油脂的抗氧化性，因此測定油脂中原花青素含量對油脂抗氧化性研究具有指導意義[13]。原花青素含量測定方法有高效液相色譜法[14]、香草醛-鹽酸法和香草醛-硫酸法[15]等方法。高效液相色譜法具有測量精度高、穩定性高和重復性好，但原料原花青素采用純甲醇提取，而原花青素更易溶于甲醇水溶液中[16]。香草醛-鹽酸法和香草醛-硫酸法弄夠用來測定原花青素，但香草醛在濃酸作用下也能與五環三萜類化合物作用形成絡合物影響測定結果[17]。

本研究在高效液相色譜法基礎上研究適合山茶油的原花青素提取及含量測定方法，以期為山茶油的進一步研究和開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茶油：冷榨冷提工藝，產地為湖南衡陽；原花青素標準品：UV≥95%；甲醇、磷酸：色譜純；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

AUW120型電子天平;UV-1750型紫外分光光度計;HH-6型恒溫水浴鍋;Agilent 1260型高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 山茶油中原花青素提取

稱取15 g樣品于燒瓶中(精確到0.000 1 g)，加入20 mL一定濃度甲醇溶液，在一定溫度下攪拌，冷凝回流萃取一定時間，離心，收集上清液(一次提取)，用相同甲醇溶液定容到100 mL，待測。

1.2.2 標準曲線制作

將原花青素標準樣品用50%甲醇溶液溶解，并制備60、80、100、120、140 μg/mL的標準梯度溶液，吸取1 mL各標準梯度溶液分別置于不同的磨口錐形瓶中，加熱真空揮干，分別加入15 mL正丁醇與鹽酸的混合液(正丁醇∶鹽酸=95∶5)，再加入0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液(用濃度2 mmol/L鹽酸配成2%的溶液)，混勻，置沸水浴回流，加熱40 min后，立即至冰水浴冷卻2 min，取出后放置室溫10 min，于波長545 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(A)，原花青素標準梯度濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 精密度試驗

取1 mL濃度為80 μg/mL的原花青素標準溶液，按照標準曲線相同條件下進行操作測定吸光度，平行6份，計算RSD值。

1.2.3.2 重復性試驗

分別吸取3 mL樣品待測液置于6個不同的磨口錐形瓶中，按照標準曲線相同條件下進行操作測定吸光度，計算RSD值。

1.2.3.3 穩定性試驗

吸取3 mL樣品待測液，按照標準曲線相同條件下進行操作，每10 min測定一次吸光度，考察1 h內吸光度的穩定性，計算RSD值。

1.2.3.4 加樣回收率試驗

取6份3 mL已知含量的樣品提取液，加入一定量的標準溶液混勻，按照標準曲線相同條件下進行操作測定吸光度，計算加樣回收率和RSD值。

1.2.4 幾種測定方法比較

方法一：取3 mL樣品待測液按照標準曲線相同條件下進行操作測定山茶油中原花青素含量。

方法二：取樣品待測液參照文獻方法[13]進行高效液相色譜法測定山茶油中原花青素含量。

方法三：稱取0.5 g油脂(精確至0.000 1 g)，用純甲醇定容至50 mL容量瓶中，移取2mL溶液參照文獻方法[13]進行高效液相色譜法測定山茶油中原花青素含量。

方法四：稱取0.5 g油脂(精確至0.000 1 g)，加入15 mL正丁醇與鹽酸的混合液(正丁醇 ∶鹽酸=95∶5)，再加入0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液(用濃度2 mmol/L鹽酸配成2%的溶液)，混勻，置沸水浴回流，加熱40 min后，立即至冰水浴冷卻2 min，取出后放置室溫10 min，于波長545 nm處測定吸光度。

1.2.5 單因素試驗

1.2.5.1 甲醇溶液濃度的選擇

采用提取溫度為70 ℃、提取時間為40 min、提取次數2次，分別考察甲醇體積分數為30%、40%、50%、60%、70%條件下對原花青素含量的影響。

1.2.5.2 水浴溫度的選擇

采用甲醇體積分數為50%、提取時間為40 min、提取次數2次，分別考察水浴溫度60、70、80、90、100 ℃條件下條件下對原花青素含量的影響。

1.2.5.3 提取時間的選擇

采用甲醇體積分數為50%、水浴溫度為70 ℃、提取次數2次，分別考察提取時間20、30、40、50、60 min條件下對原花青素含量的影響。

1.2.5.4 提取次數的選擇

采用甲醇體積分數為50%、水浴溫度為70 ℃、提取時間為40 min，分別考察提取次數1、2、3、4、5 次條件下對原花青素含量的影響。

1.2.6 正交試驗

根據單因素試驗結果，進行L9(34)正交試驗，確定出山茶油中原花青素提取的最佳工藝參數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線制作

按照1.2.2方法可得，原花青素標準樣品的回歸方程為A=0.004 3x+0.004 5(R2=0.999 4)。其濃度在60～140 μg范圍內線性良好。原花青素標準樣品的標準曲線如圖1所示。

圖1 原花青素標準樣品的標準曲線

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗

精密度試驗結果見表1。

表1 精密度試驗結果

由表1可知，精密度試驗RSD值為1.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗

重復性試驗結果見表2。

表2 重復性試驗結果

由表2可知，重復性試驗RSD值為2.43%，表明重復性良好。

2.2.3 穩定性試驗

穩定性試驗結果見表3。

表3 穩定性試驗結果

由表3可知，穩定性試驗RSD值為1.25%，表明待測樣品在1 h內穩定。

2.2.4 加樣回收率試驗

加樣回收率試驗結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果

由表4可知，加樣回收率試驗平均加樣回收率為100.18%，RSD值為1.41%，加樣回收率范圍98.70%～102.15%，表明該方法具有良好的加樣回收率。

2.3 幾種測定方法比較

幾種測定方法比較見表5。

表5 幾種測定方法比較

由表5可知，方法四比色液渾濁，直接導致原花青素含量結果嚴重偏高；方法二和方法三原花青素含量結果對比表明原花青素更易溶于甲醇溶液，因此用甲醇溶液提取更為準確；方法一和方法二原花青素含量結果非常接近，說明兩種方法都適用于山茶油中原花青素含量的測定，為操作快速、方便，選擇方法一。由方法一、方法二、方法三的原花青素含量結果與方法四的原花青素含量結果比較可知，甲醇溶液從山茶油中提取原花青素后測得的結果更為準確，因此準確測定山茶油中原花青素含量采用甲醇溶液從山茶油中先提取原花青素再進行比色測定結果。

2.4 單因素試驗

各因素對原花青素含量影響如圖2所示。

圖2 各因素對原花青素含量影響

2.4.1 甲醇濃度的選擇

甲醇溶液提取原花青素遵循相似相溶原理，調節甲醇體積分數，讓其極性接近原花青素，從而達到原花青素的最高溶解度。由圖2可知，隨著甲醇體積分數升高，原花青素含量逐漸增加，但甲醇體積分數到達60%以后，原花青素含量反而減少。因此甲醇體積分數為50%～60%時提取原花青素效果較好。

2.4.2 水浴溫度的選擇

水浴溫度對原花青素提取過程表現為兩個方面：一方面，傳質效率隨著溫度升高而增加；另一方面，溫度過高，溶解在提取溶液中的雜質增加，這些雜質使得提取混合液黏度增加，進而影響原花青素的提取效率。由圖2可知，原花青素含量隨溫度不斷升高先增加后降低，當水浴溫度達到70～80 ℃時，原花青素含量達到最大。因此水浴溫度為70～80 ℃時，原花青素提取效果較好。

2.4.3 提取時間的選擇

提取時間對原花青素提取過程的影響主要表現在提取溶劑與油脂混合，油脂中的原花青素溶解到提取溶劑中，直到油脂中原花青素濃度與提取溶劑原花青素濃度一致時，傳質達到動態平衡，而當提取時間不足時，則原花青素提取不徹底。由圖2可知，原花青素含量隨提取時間的延長先增大后趨于平衡，當提取時間為40 min時，原花青素含量達到最大，當提取時間超過40 min，原花青素含量不再增加。因此選用提取時間為40 min。

2.4.4 提取次數的選擇

提取次數對原花青素提取過程的影響主要表現在不斷降低油脂中原花青素含量，使原花青素幾乎全部溶解到提取溶液中。由圖2可知，原花青素含量隨提取次數的增加先增大后趨于平衡，當提取次數為3次時，原花青素含量達到最大，當提取次數超過3次，原花青素含量不再增加。因此選用提取次數為3次。

2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對甲醇濃度、水浴溫度、提取時間和提取次數進行4因素3水平正交試驗。正交試驗結果見表6。

表6 正交試驗結果

由表6中極差分析可知，影響原花青素含量的影響因素主次順序為：A(甲醇體積分數)>C(提取時間)>B(水浴溫度)>D(提取次數)。山茶油中原花青素最佳提取工藝組合為A2B2C2D3，即甲醇體積分數50%、水浴溫度80 ℃、提取時間40 min、提取次數4次。

對正交試驗得到的山茶油中原花青素最佳提取條件進行驗證試驗，驗證試驗結果見表7。

表7 驗證試驗結果

由表7可知，在甲醇體積分數50%、水浴溫度80 ℃、提取時間40 min和提取4 次的提取工藝條件下，測得山茶油中平均原花青素含量為265.90 mg/Kg(RSD值為1.11%，說明重復性好)。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗相結合的方法優化山茶油中原花青素的提取，影響原花青素含量的影響因素從大到小依次為：甲醇濃度、提取時間、提取溫度、提取次數。

山茶油中原花青素最佳提取工藝為甲醇體積分數50%、水浴溫度80 ℃、提取時間40 min、提取4 次；在此條件下所提取得到山茶油中平均原花青素含量為265.90 mg/kg。

山茶油中原花青素的提取優化工藝穩定可行，且原花青素含量測定方法可靠。