甜蕎米中葉綠素、總酚、PPO與褐變的關系

程 哲 郭 洪 胡俊君 何永吉 李紅梅 李云龍

(山西省農業科學院農產品加工研究所；特色農產品加工山西省重點實驗室，太原 030031)

蕎麥屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagoprumMill)，營養價值高，素有“五谷之王”的美稱，既富含蛋白質、脂肪、淀粉、維生素、微量元素和纖維等營養成分，能滿足人類補充能量的基本要求，又因功能成分的含量及活性較高，可作為藥食兼用的保健食品原料[1，2]。蕎麥常以面條、面包、茶、醋、酒等多種形式被人們食用[3-6]。

蕎麥經儲藏后內在營養成分和功能成分等品質下降[7-9]，尤其是外觀色澤劣化直接導致商品價值降低，制約著蕎麥利用和出口創匯[10]。目前，關于蕎麥品質變化的研究雖有報道，但主要集中在蕎麥原糧和蕎麥制品方面[11-14]，而針對近年來因食用方便、適口性好而深受消費者歡迎的脫殼后的甜蕎米[15,16]，其儲藏及貨架期色澤變化的相關研究尤其是機理研究較少。本研究針對脫殼后的甜蕎米從淺綠色轉變為紅褐色的褐變現象，從葉綠素、總酚含量及多酚氧化酶活性等的變化展開探討，探索其褪綠、酶促和非酶促引起的褐變過程，以期為延長甜蕎米儲藏時間和貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以2018年9月下旬成熟的品甜2號、通蕎2號和赤甜1號為原料，均由國家燕麥蕎麥產業技術體系烏蘭察布試驗站提供。

1.2 主要儀器與設備

756紫外可見分光光度計；HH-2電子恒溫水浴鍋；TGL20C冷凍離心機；NW-1色差儀。

1.3 試劑

甲醇、乙醇、沒食子酸、檸檬酸、鄰苯二酚、丙酮、磷酸氫二鈉、碳酸鈉等均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 原料預處理

將甜蕎原糧，除去沙塵、草籽等雜質，自然晾干后，分級脫殼為甜蕎米，選擇無病蟲害、無破碎的整米作為褐變前的樣品。將樣品單層平鋪，在室溫陽光下放置儲藏，分別于0、20、40、60、80 d取出一定量樣品進行跟蹤分析。

1.4.2 色度的測定

ΔE*=

1.4.3 葉綠素的測定

參考Arnon D.I.法[18-20]：

葉綠素a濃度：Ca=0.012 72A663-0.002 59A645；

葉綠素b濃度：Cb=0.022 88A645-0.004 67A663；

葉綠素總濃度：C=Ca+Cb。

1.4.4 總酚含量的測定

參照Folin-Ciocalteu 比色法測定總酚含量[21，22]。

標準曲線制作：用70%甲醇配制1 mg/mL 沒食子酸溶液，配成濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL沒食子酸標準溶液。分別吸取0.5 mL標準溶液置于試管中，加入0.8 mL福林酚試劑和0.7 mL蒸餾水，搖勻后避光放置6 min，再加2.5 mL 7%碳酸鈉溶液及2 mL蒸餾水，40 ℃水浴40 min，測定760 nm波長下的吸光值。以吸光值(A760)對沒食子酸濃度(c)線性回歸后得到回歸方程：y=9.725 3x+0.003 45，R2=0.999 3。

樣品測定：用粉碎機將待測甜蕎米粉碎，全部過60目篩，準確稱取0.500 0 g，用50 mL 70% 甲醇于65 ℃水浴中提取3 h，吸取0.5 mL上清液，測定760 nm處吸光度。甜蕎米的總酚含量表示為每克干樣中含有的多酚量(以沒食子酸計)。

1.4.5 多酚氧化酶活性的測定

參考賈愛霞等[23]和李紅軍等[24]的測定方法。稱量2.000 0 g 甜蕎米于冰浴中研磨后，轉移至50 mL離心管中，準確量取20 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸(0.1 mol/L，pH 6.0)緩沖溶液，搖勻，放置4 ℃冰箱24 h， 8 000 r/min，冷凍離心5 min，上清液即粗酶液。將加入0.5 mL鄰苯二酚(0.2 mol/L)和0.5 mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖的試管于37 ℃水浴3 min，加入0.4 mL酶液后，再于37 ℃水浴20 min，在420 nm處測定其吸光值。以測定條件下每分鐘吸光度值增加0.001定義為一個酶活力單位(U)。

1.4.6 相關性分析

采用SPSS軟件進行皮爾遜相關性分析，**表示P<0.01，為極顯著相關，*表示P<0.05，為顯著相關。

2 結果與分析

2.1 甜蕎米儲藏期色度變化

根據對蕎麥米(品甜2號)儲藏期間觀察發現，隨著儲藏時間推移，蕎麥米顏色不斷加深，圖1色度實驗結果表明，儲藏80 d，蕎麥米的ΔE*逐漸增加，其中ΔL*、Δa*和Δb*變化趨勢不一，ΔL*逐漸降低，樣品色澤由亮逐漸變暗；Δa*逐漸增加，顏色由綠色向紅褐色轉變；而Δb*則無明顯變化趨勢。

同時，將ΔL*、Δa*和Δb*均與ΔE*進行相關性分析，發現ΔL*與ΔE*極顯著負相關，Δa*與ΔE*極顯著正相關，但Δb*與ΔE*相關性不顯著(P>0.05)。因此，甜蕎米褐變過程中，色度值ΔL*、Δa*和Δb*對褐變的貢獻程度不一。

圖1 甜蕎米儲藏過程中色度變化

2.2 甜蕎米儲藏期葉綠素含量與褐變的關系

甜蕎米(品甜2號)中總葉綠素含量為(25.56±0.03) mg/kg，其中葉綠素a含量為(15.03±0.12) mg/kg，葉綠素b為(10.53±0.08) mg/kg。如圖2所示，葉綠素含量隨儲藏時間推移明顯降低，第80 d與0 d相比，總葉綠素含量降低了14.06 mg/kg，其中，葉綠素a降低程度大于葉綠素b：葉綠素a降低了9.03 mg/kg，葉綠素b降低了5.03 mg/kg，且葉綠素b在儲藏20 d，略減少0.29 mg/kg，變化趨勢不明顯，自20 d以后減少速度加快。對葉綠素含量隨時間變化進行線性回歸分析，方程分別為總葉綠素(y=-0.184 2x+26.15，R2=0.985 3)，葉綠素a (y=-0.118 2x+15.24，R2=0.979 5)，葉綠素b(y=-0.066 1x+10.91，R2=0.959 9)。斜率表明葉綠素a減少速率明顯高于葉綠素b，說明葉綠素a綠色褪去速率大于葉綠素b。

圖2 甜蕎米儲藏過程中葉綠素含量變化

對儲藏期葉綠素含量變化與色度變化進行相關性分析，結果如表1。葉綠素與ΔE*呈現顯著負相關性(P<0.05)，且與ΔL*顯著正相關(P<0.05)，尤其與Δa*極顯著負相關(P<0.01)。其中，葉綠素a與葉綠素b均與色度顯著相關，且葉綠素a與ΔE*、ΔL*和Δa*的相關系數均大于葉綠素b。結果表明，葉綠素對甜蕎米褐變有影響，且葉綠素a的影響大于葉綠素b。

表1 甜蕎米葉綠素含量變化與色度變化的相關性

注：**為極顯著相關；*為顯著相關，余同。

2.3 甜蕎米儲藏期總酚含量與褐變的關系

儲藏一段時間后的甜蕎米，生物代謝速率減緩，合成酚的能力隨之下降，且酚類物質經過一系列的氧化作用形成褐色素或類黑色素，總酚含量隨著儲藏時間推移而降低，最終發生褐變。圖3結果表明，甜蕎米中(品甜2號)總酚含量在儲藏期明顯下降，其含量變化與色度變化呈現顯著或極顯著相關性(表2)。

圖3 甜蕎米儲藏過程中總酚含量變化

因此，選3種總酚含量低[通蕎2號，(5.70±0.084) mg/g]、中[赤甜1號，(6.19±0.046) mg/g]、高[品甜2號，(6.86±0.092) mg/g]的甜蕎米樣品進行儲藏觀察。如圖4所示，3種甜蕎米發生褐變，且程度不同，從20～80 d，ΔE*、ΔL*和Δa*均是通蕎2號<赤甜1號<品甜2號，Δb*無明顯規律。整體來說，總酚含量高的品甜2號在各個時間段的褐變程度最嚴重。

甜蕎米ΔE*、ΔL*、Δa*和Δb*值與儲藏時間經多項式回歸分析，結果如表3所示。通過比較回歸方程的系數發現，3個品種的ΔE*、ΔL*和Δa*值的變化速率均是通蕎2號<赤甜1號<品甜2號，表明總酚含量高的甜蕎米的褐變速率最大。

表3 甜蕎米的色度值與儲藏時間的多項式回歸方程

圖4 3種甜蕎米儲藏過程中色度變化

甜蕎米發生褐變的同時，3個品種的總酚含量均呈降低趨勢(圖5)，儲藏80 d時，通蕎2號的總酚含量降低了0.315 mg/g，變化最小，赤甜1號和品甜2號的總酚含量降低程度相近。

將3種甜蕎米的總酚含量與色度進行相關性分析，如圖6所示，3個品種的總酚含量與ΔE*和Δa*呈負相關，與ΔL*正相關，均與Δb*無顯著相關。其中總酚含量低的通蕎2號中，總酚與各色度值的相關性均不顯著；總酚含量居中的赤甜1號中，總酚與各色度值均顯著相關；總酚含量較高的品甜2號中，總酚與ΔE*和Δa*極顯著相關，與ΔL*顯著相關。

圖5 3種甜蕎米儲藏過程中總酚含量變化

圖6 3種甜蕎米總酚含量與色度相關性

酚對甜蕎米褐變有影響，對于總酚含量低的品種，酚對褐變的影響最低，對于酚含量較高的品種，酚對褐變的影響較高。因此，從褐變的角度考慮，可以優先選擇總酚含量較低的品種儲藏甜蕎米。

同時，雖然通蕎2號、赤甜1號和品甜2號儲藏前葉綠素含量不一，但它們的葉綠素與ΔE*的相關性均顯著，相關系數分別為-0.984**、-0.954*和-0.950*。整體來說，葉綠素與色度的相關系數大于總酚，即葉綠素對褐變的影響大于酚的影響。

2.4 甜蕎米多酚氧化酶(PPO)活性與褐變的關系

蕎麥收割曬干，尤其甜蕎籽粒去皮后，細胞膜被破壞，酚酶區域化結構破壞崩潰，酚類物質與PPO接觸，引起褐變[25，26]。PPO活性在儲藏初期0～20時呈升高趨勢，并在20 d出現高峰，之后迅速下降，在儲藏60～80 d后變化速度減緩，PPO活性開始緩慢降低。可能是PPO的底物酚類物質逐漸被氧化減少，而產物醌類物質增多，從而導致酶活性下降[27]。

在甜蕎米褐變過程中，3個品種的PPO活性變化趨勢一致(圖7)，說明PPO參與了褐變過程。品甜2號的PPO活性始終高于通蕎2號和赤甜1號，表明褐變越嚴重的品種，PPO活性越高。表4顯示通蕎2號的PPO活性與酚含量顯著負相關，而與色度不顯著相關；赤甜1號的PPO活性與酚含量和色度均無顯著相關性；品甜2號的PPO活性與酚含量無顯著相關性，與色度顯著相關。

PPO對于甜蕎米的褐變影響低于酚類物質，且PPO作用于酚的酶促褐變在儲藏初期的作用大于儲藏后期。雖然儲藏后期PPO活性降低，但是甜蕎米的褐變仍在進行，從而側面印證了酚類既通過酶促又通過非酶促的方式參與了甜蕎米褐變。

圖7 甜蕎米儲藏過程中PPO活性隨時間的變化

表4 PPO活性與色度和總酚含量相關性

3 結論

甜蕎米在儲藏過程中發生褐變，色度值ΔL*、Δa*和Δb*對褐變的貢獻程度不一。葉綠素含量減少對甜蕎米褐變有影響，其中葉綠素a含量變化程度和褪綠速率均大于葉綠素b，且葉綠素a與色度相關系數亦大于葉綠素b，葉綠素a對甜蕎米褐變的影響大于葉綠素b。甜蕎米中酚類物質對褐變有影響，對于選取的總酚含量低(通蕎2號)、中(赤甜1號)、高(品甜2號)的3個甜蕎米品種，通蕎2號的總酚對褐變的影響最低。品甜2號褐變程度最大，褐變速率最快。從褐變的角度考慮，可以適度選擇總酚含量相對較低的甜蕎米品種儲藏。PPO參與了褐變過程，對甜蕎米褐變影響低于酚類物質，其作用于酚的酶促褐變在儲藏初期的作用大于儲藏后期。

甜蕎米褐變是多因素多通路共同作用的結果，其中，葉綠素、酚類物質和PPO不同程度地影響甜蕎米褐變：葉綠素影響最大，總酚次之，PPO最小。