老年AML患者在經(jīng)地西他濱治療中COX-2、VEGF及p53蛋白的表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系

王戰(zhàn)芳 張芳芳 楊海 陳超華

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，是以外周血和骨髓中原始和幼稚髓系細(xì)胞異常增生為特征的一類(lèi)惡性腫瘤。研究顯示［1］，在65 歲以上人群AML 的發(fā)病率是其他人群的10 倍，這與老年人機(jī)體抵抗力差、身體機(jī)能衰退等有關(guān)。化療是治療AML 的有效手段。但在老年患者中往往難以耐受標(biāo)準(zhǔn)劑量化療，所以阿糖胞苷+阿克拉霉素+粒細(xì)胞集落刺激因子（Ara-c+ACR+G-CSF，CAG）方案常成為老年AML 患者治療選擇。地西他濱為一種DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡具有明顯作用。陳冬等研究證實(shí)［2］，地西他濱聯(lián)合CAG 化療方案用于急性白血病的治療取得了較好的效果，改善患者預(yù)后。環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）可促進(jìn)實(shí)體瘤的發(fā)生和發(fā)展，其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，并在白血病患者中水平明顯升高［3］。腫瘤的形成依賴于血管的異常增生，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為機(jī)體重要的血管生成因子，研究認(rèn)為VEGF 與血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后存在明顯關(guān)系［4-5］。P53 基因是目前已知的與腫瘤相關(guān)的基因，其編碼的p53 蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)，可作為多種惡性腫瘤疾病診斷、治療和預(yù)后的有效標(biāo)志物［6］。因此，COX-2、VEGF、p53 蛋白可為地西他濱治療老年急性AML 患者中的效果觀測(cè)及預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)，本研究對(duì)此進(jìn)行了探究，取得了一定的進(jìn)展，具體總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月至2019年1月收治的80例AML 患者作為研究組，其中男49例，女31例，年齡60～76 歲，平均（68.8±2.4）歲，M1 型8例，M2型14例，M4 型18例，M5 型31例，M6 型9例。并選取同期于本院健康體檢者40例作為對(duì)照組，其中男24例，女16例，年齡60～78 歲，平均（68.3±2.5）歲。兩組研究對(duì)象在性別、年齡等臨床一般資料上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究?jī)?nèi)容獲得院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于AML 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②均行骨髓穿刺檢查確診；③年齡≥60 歲；④AML 的MICM 分型為M1、M2、M4、M5、M6 型；⑤所有患者及家屬均充分了解本研究并自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期行化療等相關(guān)治療者；②肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；③合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病者；④合并其他部位惡性腫瘤者；⑤不耐受本研究治療方案或中途退出研究者。

1.2 方法

所有AML 患者采用地西他濱聯(lián)合CAG 方案治療：地西他濱15 mg/m2·d，d1-d5，靜脈滴注；阿克拉霉素20 mg/d，d1-d4，靜脈滴注；阿糖胞苷10 mg/m2，q12 h，d1-d14，皮下注射；粒細(xì)胞集落刺激因子150 μg，q12 h，d1-d14，皮下注射，實(shí)驗(yàn)室檢查患者血細(xì)胞計(jì)數(shù)，白細(xì)胞＞20×109/L 時(shí)，停止用藥。所有患者在治療結(jié)束后觀察治療效果，并統(tǒng)計(jì)完全緩解和未完全緩解患者例數(shù)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 COX-2、VEGF 及p53 蛋白水平檢測(cè)

所有研究對(duì)象在入院后當(dāng)日空腹抽取5 mL靜脈血，室溫放置30 min，3 000 r/min 離心15 min分離上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定COX-2、VEGF及p53 蛋白水平，試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明下進(jìn)行。所有AML 患者在化療14 d 后再次抽取5 mL 空腹靜脈血并依照同種方法檢測(cè)上述指標(biāo)變化情況。

1.3.2 體液免疫及細(xì)胞免疫指標(biāo)檢測(cè)

所有患者在治療前及治療14 d 后采用免疫速率比濁法檢測(cè)體液免疫指標(biāo)IgA、IgG、IgM 水平，試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。采用CyFlow 全自動(dòng)流式細(xì)胞分析儀（德國(guó)Partec 公司）及其配套試劑檢測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)T 淋巴細(xì)胞亞型CD3+、CD4+、CD8+變化，并計(jì)算CD4+/CD8+。

1.3.3 預(yù)后

所有患者化療后隨訪1～5年，觀察患者生存狀況，并統(tǒng)計(jì)患者化療緩解期發(fā)生中樞神經(jīng)白血病（central nervous system leukemia，CNSL）的情況。CNSL 診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國(guó)成人急性淋巴細(xì)胞白血病診斷與治療指南（2016年版）》［8］進(jìn)行判斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。Spearman 相關(guān)性分析COX-2、VEGF 及p53 蛋白之間的相關(guān)性及其與免疫指標(biāo)的相關(guān)性；采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析COX-2、VEGF、p53 蛋白在CNSL 中的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清指標(biāo)變化情況

研究組患者治療前COX-2、VEGF 及p53 蛋白水平均顯著高于對(duì)照組，但治療后均較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究組患者治療后體液免疫指標(biāo)和細(xì)胞免疫指標(biāo)均較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)下表1。

表1 兩組血清指標(biāo)變化情況（±s）Table1 Changes of serum indicators in the 2 groups（±s）

表1 兩組血清指標(biāo)變化情況（±s）Table1 Changes of serum indicators in the 2 groups（±s）

注：對(duì)照組與研究組比較，aP＜0.05。

項(xiàng)目COX-2（ng/L）VEGF（pg/mL）p53 蛋白（ng/L）IgA（g/L）IgG（g/L）IgM（g/L）CD3+（%）CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+研究組（n=80）治療前53.2±6.1 158.8±35.7 211.5±33.8 2.3±0.9 11.7±1.9 1.0±0.2 54.2±6.6 34.2±4.3 29.0±2.7 1.2±0.3治療后31.0±3.1 72.2±7.5 108.3±13.7 1.5±0.7 9.1±1.6 0.7±0.2 38.7±4.5 28.8±3.2 20.9±2.6 0.9±0.2對(duì)照組（n=40）30.3±3.2a 70.7±6.9a 106.7±14.9a-------t 值29.019 21.233 25.309 4.276 9.362 9.487 17.355 9.011 19.328 7.442P 值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，COX-2、VEGF 及p53 蛋白之間存在明顯正相關(guān)性（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 COX-2、VEGF 及p53 蛋白與各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table2 Correlation analysis of COX-2，VEGF and p53 proteins with various indicators

2.3 不同治療結(jié)果老年AML 患者COX-2、VEGF及p53 蛋白水平及總生存期（Overall Survival，OS）比較

完全緩解組AML 患者COX-2、VEGF 及p53蛋白水平明顯低于未完全緩解組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。完全緩解組老年AML 患者OS明顯大于未完全緩解組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同治療結(jié)果老年AML 患者各指標(biāo)比較（±s）Table3 Comparison of various indicators in different treatment outcomes of elderly AML patients（±s）

表3 不同治療結(jié)果老年AML 患者各指標(biāo)比較（±s）Table3 Comparison of various indicators in different treatment outcomes of elderly AML patients（±s）

組別完全痊愈組未痊愈組t 值P 值n 48 32 COX-2（ng/L）31.5±4.4 44.1±5.3 11.555 0.000 VEGF（pg/mL）70.3±7.7 166.9±20.8 25.148 0.000 p53 蛋白（ng/L）102.3±10.4 198.7±10.8 39.997 0.000 OS（月）12.6±2.7 5.9±1.6 13.914 0.000

2.4 COX-2、VEGF 及p53 預(yù)測(cè)CNSL 的ROC 曲線

ROC 曲線結(jié)果顯示，COX-2、VEGF、p53 蛋白及聯(lián)合檢測(cè)在CNSL 診斷中的曲線下面積（AUC）分別為0.836（95%CI：0.776～0.896）、0.802（95%CI：0.730～0.873）、0.716（95%CI：0.639～0.793）及0.905（95%CI：0.863～0.947）。見(jiàn)圖1。

圖1 COX-2、VEGF 及p53 預(yù)測(cè)CNSL 的ROC 曲線Figure1 COX-2，VEGF and p53 predict ROC curves of CNSL

3 討論

隨著化療藥物和治療方案的不斷改進(jìn)完善，AML 患者的臨床療效得到了顯著提升，但仍有相當(dāng)部分患者病情控制較差，這在老年患者中更為常見(jiàn)。采用地西他濱進(jìn)行去甲基化治療聯(lián)合CAG 方案為老年AML 的常用治療方案。去甲基化治療可促進(jìn)白血病細(xì)胞由G0 期進(jìn)入細(xì)胞周期，增加S 期細(xì)胞數(shù)量，從而提升化療藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷效果［9］。地西他濱可以滲入DNA 鏈，抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)甲基化，從而激活抑癌基因，起到抗AML 的效果［10］。在實(shí)體腫瘤的形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中與新生血管存在密切相關(guān)性，新生血管是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)［11］，抑制腫瘤血管生成，可切斷腫瘤組織的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給，從而使其喪失營(yíng)養(yǎng)來(lái)源而萎縮凋亡。

研究表明［12］，COX-2 通過(guò)多個(gè)途徑參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其可直接參與腫瘤血管新生；COX-2 及其前列腺素產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞DNA 合成和細(xì)胞增殖；COX-2 還可抑制腫瘤下?lián)艿蛲觯l(fā)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫平衡失調(diào)。多項(xiàng)研究表明［13-14］，COX-2 在多種血液腫瘤疾病中存在明顯高表達(dá)的情況。VEGF 為血管通透因子，能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，從而加速血管內(nèi)皮細(xì)胞形成，促進(jìn)心血管形成，其還能調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和眼性細(xì)胞因子的發(fā)育和表達(dá)，增強(qiáng)血管通透性。研究發(fā)現(xiàn)［15］，在ALL、AML、CLL 等患者的外周血和骨髓均存在VEGF 及其受體高表達(dá)的情況。VEGF 在白血病細(xì)胞中大量合成釋放，VEGF 在與其受體結(jié)合后促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，減少白血病細(xì)胞凋亡。p53 蛋白與腫瘤密切相關(guān)，p53 基因突變可導(dǎo)致其喪失對(duì)DNA 修復(fù)、細(xì)胞增殖、凋亡等的調(diào)控作用，因此血清p53 蛋白水平提示了機(jī)體抗腫瘤能力［16-17］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)地西他濱聯(lián)合CAG 方案化療后，老年AML 患者的COX-2、VEGF 及p53 蛋白水平均顯著降低。提示，地西他濱聯(lián)合化療可明顯降低老年AML 患者血清COX-2、VEGF 及p53 蛋白水平，緩解患者病情。

本研究結(jié)果提示AML 患者在治療后存在機(jī)體細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)。加上老年人群自身免疫功能較差、機(jī)體機(jī)能退化等，從而影響了老年AML 患者的預(yù)后。本研究中未完全緩解患者較完全緩解患者COX-2、VEGF 及p53 蛋白較高，OS 明顯降低。提示，COX-2、VEGF、p53 蛋白水平為評(píng)估AML 患者治療效果的有效指示指標(biāo)。ROC 曲線結(jié)果顯示，COX-2、VEGF、p53 聯(lián)合檢測(cè)在CNSL 診斷中的AUC 明顯高于3 者單一檢測(cè)。提示，COX-2、VEGF 及p53 蛋白聯(lián)合應(yīng)用在AML 患者地西他濱治療后的預(yù)后評(píng)估和預(yù)測(cè)患者CNSL 的發(fā)生中存在明顯價(jià)值。綜上所述，COX-2、VEGF 及p53 蛋白水平檢測(cè)對(duì)于老年AML 患者應(yīng)用地西他濱化療臨床治療效果觀測(cè)及預(yù)后評(píng)估具有顯著價(jià)值。