17β-雌二醇對rBMSCs肝祖細胞定向分化及Wnt信號通路的調控作用

曾令鋒 黃俊宇 熊瑤 張志東 王景浩 黃碩 韋宏成★

人工肝支持系統（artificial liver support system，ALSS）作為替代肝臟功能的治療方法，可暫時延緩或維持晚期肝臟疾病患者的生命，包括非生物型、生物型以及混合型。研究表明，生物型人工肝通過穩定的體外培養肝細胞生物反應器，發揮肝細胞多種功能，能明顯降低病死率，是未來人工肝發展的方向［1-2］。因此，如何在體外獲得穩定的肝細胞源，是人工肝技術發展的關鍵。骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可直接分化成肝細胞，降解細胞外基質蛋白，減少細胞外基質沉積，并刺激肝細胞功能的修復和免疫調節等方式，從而改善肝功能，減緩肝硬化進程。另外，研究表明［3-6］，雌激素對肝硬化具有保護作用。目前，BMSCs肝向分化的機制和雌激素是否影響大鼠骨髓間充質干細胞（rat Bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）肝向分化均尚不清楚。本研究通過體外誘導rBMSCs定向分化成肝祖細胞，探討17β-雌二醇（17β-estradiol，17β-E2）對rBMSCs肝祖細胞向分化的影響及其潛在作用機制，驗證17β-E2是否通過調控Wnt 信號通路影響rBMSCs肝祖細胞向分化。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

rBMSCs由暨南大學腫瘤研究所捐贈。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM 培養基（美國HyClone）；成骨誘導完全培養基、成脂誘導完全培養基、D-Hanks 平衡鹽緩沖液（廣州PanEra）；優級胎牛血清（天津灝洋）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco）；17β-雌二醇（西安嘉博盈）；CCK-8 試劑盒（北京Dojindo）；CD29 抗體、CD45 抗體、CD80 抗體、CD90 抗體（美國Biolegend）；Tris-HCL（pH 8.3））（北京索萊寶）；β-Catenin 蛋白抗體、Wnt3a 蛋白抗體、LRP-5 蛋白抗體、GAPDH 蛋白抗體、WB 一抗稀釋液（美國CST）。單人雙面凈化工作臺（上海一恒SW-CJ-IF）、CO2培養箱（美國Thermo Scientific3111 型）、低速/高速離心機（德國eppendorf Centrifuge 5702）、倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS CK40）、酶標儀（美國Bio-Rad680 型）、流式細胞儀（美國BD FACSAria 型）。 微量核酸蛋白定量儀（上海Boyue ScanDrop 100）、轉膜儀（北京 賽百奧17-4070）、凝膠成像系統（上海天能Tanon-1600）、水平電泳槽（上海天能HE-120）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與細胞增殖

取P3-P5代的rBMSCs，培養于25 cm2培養瓶中，條件：37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，每3 d 換液，待細胞鋪滿整個培養瓶，以1∶2 比例進行傳代。細胞分為4 組：α-MEM 完全培養基（Control）組、15% FBS 成肝誘導完全培養基（經典）組、（10-6mol/L）17β-E2+α-MEM 完全培養基（E2）組、（10-6mol/L）17β-E2+成肝誘導完全培養基（經典+E2）組。

取P3-P5代的rBMSCs，棄去培養基，用D-Hanks液清洗2 次及胰酶消化制成單細胞懸液。96 孔板中每孔接種2 000 個細胞，設置6 個復孔，共6 行10 列，每孔加入200 μL 完全培養基，放入37℃、5%CO2培養箱中培養；隔日起，每日取1 列6 孔進行CCK-8 細胞活性檢測，每孔100 μL 培養基加入10 μL CCK-8 溶液，并置于培養箱中孵育2.5 h 后，置于酶標儀下，調零后測量在450 nm 處的吸光度（OD 值）。以時間（天）為橫坐標，OD 值為縱坐標繪制rBMSCs生長曲線。

1.3.2 細胞流式

制成單細胞懸液。2 000 rpm 離心6 min，去上清，用D-Hanks 液重懸細胞，重復3 次，取300 μL 單細胞懸液于1.5 mL 離心管中，再加入700 μL 無水乙醇，充分混勻，用封口膜封閉，4℃過夜。D-Hanks 液洗滌2 次，取500 μL 重懸細胞，1 600 rpm 離心10 min，棄上清，加入200 μL PI 染液，混勻，室溫避光孵育15 min，過濾，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.3rBMSCs表面標志物測定

制成單細胞懸液并調整密度為1×106cells/mL；按操作說明分別加入CD29、CD45、CD80、CD90，37℃下孵育30 min；使用流式細胞儀測定；

1.3.4rBMSCs骨向及脂向分化能力鑒定

按1.4.1 操作培養細胞，待細胞融合60%左右分別加入成骨誘導培養基、成脂誘導培養基，待細胞長滿后，棄去培養瓶中培養基，用D-Hanks 液清洗3 次，分別加入95%乙醇固定10 min，用蒸餾水漂洗3 次，分別加入0.1% Tris-HCL-茜素紅染液、飽和油紅O 染液37℃孵育45 min、60 min，用蒸餾水漂洗多余Tris-HCL-茜素紅染液，60%異丙醇漂洗多油紅O 染液，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5rBMSCsAFP 的測定

按1.4.1 及1.4.2 操作培養細胞，第3、6、10 天對4 組細胞重懸并進行裂解，取300 μL 置于化學發光免疫分析儀上測定各組AFP 值。

1.3.6 Wnt 信號通路的調控作用

按1.4.1及1.4.2操作培養細胞，制成單細胞懸液，離心后加入細胞裂解液，置于冰上；提取總蛋白，微量核酸蛋白定量儀測定總蛋白濃度，以1∶4 比例加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻，99℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫，灌膠、電泳，轉膜，一抗（β-Catenin、Wnt3a、LRP-5）4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2 h，顯影。

1.3.7 統計學方法

采用SPSS 13.0 軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料以（）表示，多組間的差異比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用Bonferroni 檢驗分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rBMSCs 的鑒定

鏡下見rBMSCs呈貼壁生長，細胞呈放射狀、梭形或平行排列。且細胞形態隨傳代次數的增多而表現的越均一。見圖1A。rBMSCs呈倒“S”形增長，從第2 d 開始快速增長，第8 d 到達頂峰，隨后逐漸進入平臺期，增長較為緩慢。見圖1B。rBMSCsG0/G1期細胞為87.5%，G2+S/M 期細胞為12.5%，表明大部分rBMSCs處于靜息期，只有少部分細胞處于增殖期，符合干細胞生物學特性。見圖1C。

圖1 rBMSCs 的鑒定Figure1 Identification of rBMSCs

2.4 rBMSCs 表面標志物的鑒定

結果顯示rBMSCs表達CD29、CD90 的陽性率為99.72%、97.45%；而CD45、CD80 的陽性率為1.28%、1.01%，符合干細胞生物學特性。見圖2。

圖2 P4代rBMSCs 表面標志物的鑒定Figure2 Identification of surface markers of P4

2.5 rBMSCs 骨向及脂向分化能力鑒定

成骨誘導第14 天后，對rBMSCs進行茜素紅染色，鏡下可見礦化結節中沉積的鈣鹽被染成紅褐色，而周圍細胞未著色。見圖3A。對rBMSCs進行油紅O 染色，鏡下可見脂肪細胞因脂質累及被染成紅色。見圖3B。

圖3 rBMSCs 的骨向及脂向分化能力鑒定（×100）Figure3 Identification of differentiation potency ofrBMSCs from P4 generation（×100）

2.7 rBMSCs 向肝祖細胞定向誘導后形態學變化

第3 天，經典組與經典+E2組的rBMSCs由長梭形逐漸呈多邊形、類圓形改變，細胞增殖速度減緩，核漿比例變小，貼壁能力逐漸減弱，至第10 天，大多數細胞失去原有形態，呈三角形或肝板樣排列，與肝祖細胞形態相似。而Control 組和E2組無明顯形態學改變，基本呈均勻的長梭形。見圖4。

圖4 各組rBMSCs 定向誘導3、6、10 d 后細胞形態（×100）Figure4 Cell morphology after 3、6 and 10 days ofrBMSCs induction in each group（×100）

2.8 各組rBMSCs AFP 值的測定

Bonferroni 檢驗結果，不同組間AFP 值均數顯著不同（F=8.948，P=0.012），差異有統計學意義，而不同天數間AFP 值均數無明顯改變（P＞0.05），差異無統計學意義。經典組、經典+E2組的AFP 值顯著增高于Control、E2組（P＜0.05），且經典+E2組AFP 值顯著高于經典組（P＜0.05），而Control、E2組AFP 值均為0 ng/mL。見圖5。

圖5 各組rBMSCs AFP 均值Figure5 Average AFP ofrBMSCs in each group

2.9 各組rBMSCs 肝祖細胞向分化過程中Wnt 信號通路的表達情況

運用Western Blot 法分別檢測第3、6、10 天各組rBMSCs 中Wnt3a、β-Catenin、LRP-5 的蛋白表達量。與Control 組及E2組相比，經典組與經典+E2組中的β-Catenin、Wnt3a 表達量均顯著降低（P＜0.05），且經典+E2組β-Catenin、Wnt3a 表達量均顯著低于經典組（P＜0.05）；而4 組間LRP-5 的表達差異均無顯著性（P＞0.05）；且不同天數間各組β-Catenin、Wnt3a、LRP-5 的表達差異均無顯著性（P＞0.05）。見圖6。

3 討論

肝纖維化是一個不可逆的過程，若發展為肝硬化失代償期，目前治療手段有限，且病死率高。最近，肝細胞移植成為了國內外研究的熱點［7-8］，但如何構建穩定安全的功能性肝細胞體外培養體系仍是一個難題。BMSCs 來源于骨髓，是一類具有多向分化潛能的干細胞，其易于獲取、增殖迅速及無排斥反應等優點，無需考慮倫理問題，是較為理想的肝細胞源。

圖6 各組Wnt 信號蛋白的表達Figure6 Expression of Wnt signaling protein in each group

rBMSCs源于大鼠骨髓，倒置顯微鏡下觀察原代的rBMSCs多呈類圓形，貼壁生長，隨著傳代次數增多，逐漸變為長梭形，呈簇狀生長，且形態越均一。rBMSCs在骨髓有核細胞中含量不足0.1%，且其生物學特性易在體外擴增時被破壞［9］，由此，尋找一種合適的體外培養體系極為重要。本實驗運用全骨髓貼壁法體外培養rBMSCs，通過驗證，均符合干細胞生物學特性，從而建立了穩定的rBMSCs體外培養體系。

研究發現［10-11］，雌激素作用于BMSCs 時，除了影響其分泌生長激素的量，還可降低在氧化應激時的凋亡率，其中可能與促進抗凋亡因子及抑制凋亡因子的表達相關。而雌激素影響BMSCs 的增殖、分化和遷移的機制主要通過核受體及質膜受體信號通路，前者指雌激素與雌激素受體相結合，作為轉錄因子啟動基因轉錄，從而刺激BMSCs的核酸合成；后者則指通過與質膜上表達的雌激素受體相結合，激活細胞內信號通路，影響BMSCs的增殖［12-13］。本實驗結果證實17β-E2可促進rBMSCs向肝祖細胞分化，其機制可能與17β-E2促進rBMSCs活化，抑制其凋亡，進而促使更多的rBMSCs向肝祖細胞分化相關。

Wntβ-catenin 信號通路作為經典的Wnt 信號通路，在細胞的增殖分化、動物胚胎形成等事件中起重要作用［14-16］。研究發現，Wntβ-catenin 信號通路在非肝細胞的內胚層細胞轉變成肝細胞的過程中起著關鍵的作用。本實驗通過Wersten Blot 法檢測4 組rBMSCsWnt3a、β-Catenin、LRP-5 的蛋白表達量，結果示經典+E2組Wnt3a、β-Catenin 蛋白含量明顯低于其它3 組，從而推測17β-E2可能通過調控Wntβ-catenin 信號通路來促進rBMSCs向肝祖細胞分化。其機制可能與17β-E2下調Wntβcatenin 信號蛋白Wnt3a 和β-Catenin 有關。