高靈敏度HCV RNA檢測在術前篩查中的應用

何宇婷 陳雪芳 陳培松 黃浩 余學高 黃彬★

丙型病毒性肝炎（viral hepatitis type C，HC），簡稱丙型肝炎，由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起，是世界性重大衛生問題之一。據報道，丙型肝炎病毒在2015年全球的流行率達到1%，相當于全球有7 110 萬丙肝患者［1］。HCV 感染后，基因組RNA 只在宿主細胞中復制翻譯，并不會把病毒基因組整合到宿主染色體上，經過有效治療，丙型肝炎可以被徹底治愈［2］。HCV 多呈隱匿性感染，少數表現為急性肝炎，易向慢性肝炎轉變，75%～85%的急性丙肝可發展為慢性肝炎，甚至進一步發展為肝硬化和肝癌［3］。HCV 主要通過血液傳播，同時醫源性傳播的風險也較高，特別是對于器官移植的病人及血透與腹膜透析的病人。為有效防止醫源性HCV 感染，術前必須對HCV 感染進行篩查。目前臨床上在術前篩查中主要通過免疫學方法對HCV 抗體進行檢測，從而達到對丙型肝炎的初步篩查。該方法可反映患者HCV 感染的免疫狀態，但易漏檢隱匿性感染或感染初期機體未產生特異性抗體的窗口期感染者。HCV RNA 檢測能直接反映體內HCV 的復制情況，對丙型肝炎患者做出正確診斷。本研究對術前篩查患者分別采用高靈敏度實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）法檢測HCV RNA 和化學發光微粒子免疫分析法（chemiluminescence microparticle immunoassay，CMIA）檢測HCV 抗體，對檢測結果進行比較，分析兩種方法的優勢和劣勢，探討高靈敏度HCV RNA 檢測在術前篩查中的應用價值，為臨床醫生準確診斷丙型肝炎和區分現癥和既往感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019年1月至10月間中山大學附屬第一醫院術前篩查患者血清標本1 005例。血清標本分成兩份，一份用于HCV 抗體檢測，另一份保存于-80℃備用，用于HCV RNA 檢測，避免反復凍融。

1.2 主要試劑與儀器

Architect anti-HCV 試劑盒購自美國Abbott 公司；高靈敏度HCV RNA 檢測試劑盒與核酸提取純化試劑購自中山大學達安基因股份有限公司，高靈敏度HCV RNA 檢測試劑盒靈敏度為20 IU/mL，線性范圍50～108IU/mL；Architect-i2000SR 免疫分析儀購自美國Abbott 公司，ABI 7500 型熒光定量PCR 儀購自美國Life Technologies 公司，Smart 32 型半自動核酸提取儀購自中山大學達安基因股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血清中HCV 抗體的檢測

根據試劑盒說明書，采用CMIA 法，用Architect-i2000SR 對HCV 抗體進行檢測，當HCV 抗體的S/CO 值大于或等于1 時，判斷為HCV 抗體陽性。

1.3.2 高靈敏度HCV RNA 檢測

按照核酸提取純化試劑說明書，應用Smart 32半自動核酸提取儀對收集到的血清進行核酸提取。HCV RNA 的擴增程序為：50℃15 min 1 個循環；95℃15 min，1 個循環；94℃15 s，55℃45 s，45個循環。高靈敏度HCV RNA 試劑盒的最低檢測限為20 IU/mL，羧基熒光素（carboxy-fluorescein，FAM）熒光檢測通道無明顯對數增長，或定量結果低于高靈敏度HCV RNA 試劑盒檢測下限，判斷為HCV RNA 陰性；若FAM 檢測通道和VIC 檢測通道均有對數增長期，且定量結果大于20 IU/mL，判斷為HCV RNA 陽性。

1.3.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行分析；應用Spearman進行相關性分析，采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）對指標的診斷效能進行評價。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高靈敏度HCV RNA 檢測與CMIA 法抗體檢測結果的比較

在收集的1 005例術前篩查樣本中，HCV 抗體陽性22.7%（228/1005）。228例HCV 抗體陽性的樣本中HCV RNA 檢測陽性為36.4%（83/228），HCV RNA 檢測陰性為63.6%（145/228））。HCV 抗體陰性777例，未在抗體陰性的樣本中檢測到HCV RNA 陽性的樣本。見表1。以高靈敏度HCV RNA 檢測作為HCV 病毒血癥金標準，CMIA法檢測HCV 抗體反映HCV 病毒血癥的靈敏度與特異度分別為100%與78.3%，陽性預測值和陰性預測值分別是36.4%和100%，符合率為85.6%。

2.2 HCV 抗體S/CO 值與高靈敏度HCV RNA 檢測結果的比較及相關性分析

將HCV 抗體陽性樣本按照S/CO 值進行分組，見表1。隨著S/CO 值的升高，陽性率有所升高。同時做S/CO 值與HCV RNA 定量值的散點圖，進行相關性分析，見圖1。線性擬合方程為Y=0.06 617X+4.259。Spearman相關系數r2=0.002，P=0.69，提示HCV 抗體S/CO 值的高低與HCV RNA定量值之間并無相關性。

表1 HCV 抗體S/CO 值與高靈敏度HCV RNA 檢測結果的分布［n（%）］Table1 Distribution of HCV antibody S/CO value and high-sensitivity HCV RNA detection results［n（%）］

圖1 HCV 抗體S/CO 值與高靈敏度HCV RNA 定量檢測結果的散點圖Figure1 Scatter plot of HCV antibody S/CO value against high-sensitivity HCV RNA quantitative detection results

2.3 HCV 抗體S/CO 值對預測丙型肝炎病毒血癥的效能評價

HCV 抗體S/CO 值對丙型肝炎診斷的ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.872 4，由ROC 曲線可算出，以S/CO 值≥10.7 作為預測HCV病毒血癥的截斷值，即cut-off 值時，最大的約登指數Youden's index 0.705 2，此時的靈敏度與特異度分別為92.59%和77.93%。以S/CO 值≥1 作為初篩HCV 病毒血癥的臨界值，228例HCV 抗體陽性樣本中，HCV RNA 陽性率只有36.4%（83/228）。見圖2。

圖2 HCV 抗體S/CO 值對預測丙型肝炎病毒血癥的ROC 曲線Figure2 ROC curve of HCV antibody S/CO value for predicting hepatitis C viremia

3 討論

臨床上，對于丙型肝炎感染者進行早期、及時、準確的診斷是臨床治療的關鍵。目前，臨床上檢測HCV 感染的方法主要有血清學檢測技術和分子診斷檢測技術。血清學檢測即利用病毒抗原或針對病毒抗原的特異性抗體檢測患者體內HCV血清標志物，包括HCV 抗體和HCV 抗原［4］。通常情況下，丙型肝炎抗體在患者感染HCV 2 個月后才能被檢測出來。因此，丙型肝炎抗體的檢測不能早期診斷HCV 感染［5］。HCV 抗體檢測易漏檢感染窗口期、病毒隱匿性感染或者血清中病毒拷貝數極低的患者，其檢測具有一定的局限性。近年來，高靈敏度熒光定量PCR 通過設計針對病毒保守序列的特異性引物對病毒及其變異株進行檢測，直接檢測病毒核酸，是病毒感染的確診方法，且PCR 自動化程度隨著科技發展越來越高，操作趨于簡單化，在臨床上應用廣泛。

Baleriola C 等［6］通過定量檢測儲存在-20℃和-70℃的HCV RNA 血漿樣本發現，-20℃儲存1.2年以及-70℃儲存9年才會引起HCV RNA具有統計學差異的變化。本研究將血清標本置于-80℃儲存，1年之內檢測HCV RNA 并不會影響HCV RNA 定量結果的準確性。在228例HCV 抗體陽性標本中，陽性率為36.4%。這可能是由于某些HCV 慢性感染者，HCV 抗體可持續陽性而血清中HCV RNA 因抗病毒治療而處于極低復制水平或病毒已被清除，高靈敏度HCV RNA 定量檢測不到。之后對不同的S/CO 值范圍對應的HCV RNA檢測結果進行分析，隨著S/CO 值的升高，陽性率似乎有所升高，通過Spearman 相關性分析發現，HCV 抗體S/CO 值與HCV RNA 定量值之間無相關性，S/CO 值的高低不能反映HCV 病毒體內的復制狀況。隨后ROC 曲線分析表明，當S/CO 的cutoff 值為10.7 時可獲得良好的預測價值，臨床上以S/CO 值≥1 作為初篩丙型肝炎病毒血癥的cut-off值，在判斷為HCV 抗體陽性的樣本中HCV RNA陽性檢出率低，不能對HCV 病毒血癥進行較好的預測。Pan J，Kao HH 與Ranjbar Kermani，F 等［7-9］多數研究者通過檢測HCV 抗體陽性的樣本均發現，以S/CO 值≥1 作為丙型肝炎病毒血癥的cutoff 值，存在一定比例的HCV 抗體陽性而HCV RNA 陰性的樣本。基于上述優勢，HCV 抗體檢測可用于HCV 感染者的篩查，而HCV RNA 定量檢測適用于HCV 現癥感染的確認、HCV 病毒載量分析以及對治療結束后的療效評估［10］。高靈敏HCV RNA 定量檢測（最低檢測限小于15 IU/mL）已被美國疾病控制與預防中心、歐洲肝病學會、我國肝臟病學會和傳染病學會推薦對HCV 感染者進行檢測［11］。

Ha J 等［12］運用HCV RNA 檢測對32 127例Architect anti-HCV 試劑盒檢測為HCV 抗體陰性的樣本進行檢測，發現8例（0.02%，8/32 127）HCV RNA 陽性。陳冬等［13］在148 590 份ELISA 法檢測為HCV 抗體陰性的標本中檢測出HCV RNA 陽性298例，陽性率為0.2%。葉賢林等［14］在307 440例ELISA 法檢測為HCV 抗體陰性的標本中檢測出1例HCV RNA 樣本，檢測率為0.000 325%。這可能是由于患者處于感染窗口期或者患者處于免疫抑制狀態，無法產生或產生極低水平的特異性抗體。此外，也可能是HCV 基因變異或亞型感染及隱匿性肝炎［15］。本研究中未發現HCV 抗體陰性而HCV RNA陽性標本，這可能與地區流行率有關，后續需擴大樣本量以獲得更準確的結果。

綜上所述，高靈敏度HCV RNA 的定量檢測用于術前篩查丙肝感染者，窗口期短，能準確、及時地反映患者HCV 感染狀態，HCV 在患者體內的復制情況，與傳統術前篩查方法相比，能區分現癥感染與既往感染，可有效防止醫源性傳播。