兩種滅活方法對2019新型冠狀病毒咽拭子標本病毒核酸檢測結果的影響

姜蕾 張麗媛 劉大寧★

2019 新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）是一種單鏈RNA 冠狀病毒，基因組序列由29 903 bp 構成，該基因組擁有10 個基因，可以有效地編碼10 個蛋白。2019-nCoV 可引起呼吸道感染，目前WHO 已確定其感染所致肺炎統一命名為“新型冠狀病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）”。目前，新型冠狀病毒肺炎并沒有特定的治療方法，早期診斷與早期隔離是防止疫情擴散的關鍵，因此，及時篩查出確診病人是疫情控制的首要任務［1-2］。在最新版本（新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案）的診療方案中，新型冠狀病毒核酸的檢出是確診依據，熒光定量PCR 技術為新型冠狀病毒核酸檢測的主要方法［3］。新型冠狀病毒具有較強的傳染性，在進行核酸檢測過程中，實驗室的檢測人員具有較大的感染風險。本研究比較兩種不同咽拭子標本滅活方法對熒光定量PCR 實驗結果的影響，為防止實驗室內感染和傳播，保護實驗室檢測人員的安全提供有效的安全方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2020年2月1日以來濮陽地區確診病例3例，依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》和《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》，符合相關流行病學、臨床表現，以及咽拭子檢測2019-nCoV 核酸陽性。

1.2 試劑和儀器

病毒RNA 提取試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供、熒光定量RT-PCR 試劑由中山大學達安基因股份有限公司（試劑A）和上海之江生物科技股份有限公司提供（試劑B）。RNA 樣本保存液由廣州邦德盛生物科技有限公司提供。熒光定量PCR 儀為ABI7500（Life Technologies，NY，USA）。

1.3 標本采集與處理

被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤，被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3 次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3 次，將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

每份標本分為三組，每組提取140 μL，分別采用三種處理方法，未滅活加入280 μL 生理鹽水，56℃滅活30 min 后加入280 μL 生理鹽水和加入280 μL 胍鹽RNA 保存液滅活。

1.4 核酸提取

中山大學達安基因股份有限公司的核糖核酸（RNA）抽提試劑盒，在生物安全柜內對咽拭子樣本進行核酸提取，嚴格安裝說明書上的操作步驟提取病毒提取液。

1.5 上機檢測

使用兩種不同的核酸檢測試劑對樣本進行實時熒光定量PCR 檢測。

1.6 統計學分析

Graphpad Prism 8.0 軟件進行統計學分析。Spearman 相關系數對不同處理的標本CT 值進行相關性分析，采用Bland-Altman 圖對CT 值一致性進行分析。

2 結果

2.1 3 組qPCR 結果相關性分析

用試劑A 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值相關性分析，Spearman 相關系數為r=0.9959（P＜0.001）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9958（P＜0.001）；56℃滅活30 min 組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9966（P＜0.001），見圖1。用試劑B 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min 組CT 值相關性分析，Spearman 相關系數為r=0.9886（P＜0.001）；未滅活組與胍鹽RNA保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9967（P＜0.001）；56℃滅活30 min 組與胍鹽RNA保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9915（P＜0.001），見圖2。用試劑A 與試劑B 兩種不同的試劑同時檢測，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性明顯。

2.2 3 組qPCR 結果一致性分析

用試劑A 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值差異性分析，偏差=0.3055（圖3a）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值差異性分析，偏差=0.2335（圖3b）；56℃滅活30 min 組與胍鹽保存液滅活組CT 組差異性分析，偏差=0.2640（圖3c）。用試劑B 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值差異性分析，偏差=0.1643（圖4a）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值差異性分析，偏差=0.06325（圖4b）；56℃滅活30 min 組與胍鹽保存液滅活組CT 組差異性分析，偏差=0.1472（圖4c）。Bland-Altman 分析結果顯示，用試劑A 與試劑B 兩種不同的試劑盒同時檢測，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果具有較好的一致性。

圖1 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性分析（試劑A）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit A）

圖2 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性分析（試劑B）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit B）

圖3 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果一致性分析（試劑A）Figure3 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit A）

圖4 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果一致性分析（試劑B）Figure4 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit B）

2.3 不同檢測試劑對同一種標本處理方法下檢測結果一致性分析

試劑A 與試劑B 檢測結果CT 值差異性分析，偏差=1.031（圖5）。Bland-Altman 分析結果顯示，兩種試劑盒檢測同一標本，qPCR 結果具有良好的一致性。

圖5 兩種檢測試劑對同一標本處理方法下檢測qPCR結果一致性分析Figure5 Consistency analysis of qPCR results between the two test reagents treated the same specimen

3 討論

新型冠狀病毒屬于β 屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或者橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。其基因特征與SARA-CoV 和MERS-CoV有明顯區別。目前研究顯示與蝙蝠SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達85%以上。對冠狀病毒理化特征的認識多來自對SARA-CoV 和MERS-CoV 的研究。病毒對紫外線和熱敏感，56℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯已定不能有效滅活病毒。經呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑［4］。在相對封閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能。檢驗人員在做好生物安全防護外，在不影響結果的前提下，若能在檢測前將標本進行滅活處理，將大大降低感染的幾率［5］。本研究通過2019新型冠狀病毒樣本核酸提取前，用兩種不同滅活方法分別處理咽拭子標本，對熒光定量PCR 檢測結果進行統計學分析。

本研究選用兩種滅活方法處理咽拭子標本，56℃30 min 加熱滅活和胍鹽病毒保存液滅活。胍鹽可使蛋白質變性，溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。胍鹽可對新型冠狀病毒2019-nCoV 臨床樣本進行蛋白質變性而起到滅活作用，大大降低了檢驗過程中的生物傳染風險。胍鹽不僅具有沉淀蛋白質的作用，還具有抑制核酸酶的作用，從而保證釋放出來的核酸不被降解。

本研究用兩種新型冠狀病毒核酸檢測試劑同時檢測，Spearman 相關系數對不同處理的標本CT值進行相關性分析后得出，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性明顯。Bland-Altman 分析結果顯示，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果具有良好的一致性。

綜上所述，56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活對于檢測2019-nCoV 核酸結果無影響，可在檢測前滅活以降低檢驗人員感染風險。在后續的研究中，需加大標本量，將有助于進一步明確不同滅活處理對于檢測結果的影響。