正交試驗優選復方痛風顆粒的提取工藝

唐勇琛，李擁軍，張亞洲

(1. 柳州市中醫醫院，廣西 柳州；2. 貴州中醫藥大學，貴州 貴陽)

0 引言

復方痛風顆粒是在廣西柳州市中醫醫院風濕病科用于治療痛風的臨床經驗方“健脾化濁湯”的基礎上擬研制開發的純中藥制劑，該方由白術、紫蘇梗、薏苡仁、車前子、枇杷葉5 味中藥組成。通過近年來的臨床觀察證明了其臨床療效和促進尿酸排泄作用而廣泛用于痛風的輔助治療。方中白術健脾燥濕，健運中焦，散精于肺為君；紫蘇梗寬胸利膈，解魚蟹毒，增強中焦運化為臣；薏苡仁、車前子利濕化濁，助尿酸從膀胱排除為佐；枇杷葉肅降肺氣，讓精氣得于正常運行為使；諸藥合用共奏健脾肅肺、利濕化濁之功。方中藥材紫蘇梗、枇杷葉含有大量酚酸類化合物，且具有抗氧化、抗血小板活性、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗炎、保肝和促進尿酸排泄作用等[1-2]。為了確保后期質量的穩定可控，本研究采用L9(34) 正交試驗及綜合評分法，以總酚的含量和收膏率為考察指標，對提取工藝參數進行優化，篩選出復方痛風顆粒的最佳水提工藝，從而保證其結果的科學合理性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2550 型紫外- 可見分光光度儀( 日本島津)；AB135-S 型電子分析天平( 瑞士梅特勒- 托利多儀器有限公司)；DL-800 型超聲波清洗器( 上海之信儀器有限公司，功率：800W，頻率：40-60 kHz)；DRT-TW 型調溫電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)；HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DH64型電熱恒溫干燥箱(上海市躍進醫療器械一廠)；LK-1000A 型搖擺式高速中藥粉碎機(浙江溫嶺市創力藥材器械廠)。

1.2 藥品和試劑

沒食子酸對照品(純度91.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201403)；白術、紫蘇梗、薏苡仁(廣西柳州百草堂藥業有限公司，批號：20140708)；車前子、枇杷葉( 國藥控股柳州有限公司，批號：20140511)。

無水碳酸鈉(分析純，20160324，上海試劑總廠)，鎢酸鈉(分析純，20140910，國藥集團化學試劑有限公司)，鉬酸鈉( 分析純，20150218，上海凌峰化學試劑有限公司)，硫酸鋰( 分析純，20130825，重慶東方試劑廠)；磷酸(分析純，20160913，北京化工廠)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 水提工藝的正交試驗設計

結合文獻報道[3-7]，采用正交試驗法對復方痛風顆粒的提取工藝進行優選。選取加水量(A)、提取次數(B)和提取時間(C)作為考察因素，每個因素3 個水平，以總酚的含量和收膏率作為評價指標，采取綜合加權評分的方法進行優選：總酚的權重系數為0.6，收膏率的權重系數為0.4，總酚和收膏率的最高測量值分別為滿分60 和40，每項綜合得分=單個測量值/單個最高值×權重系數。按L9(34)安排試驗。因素水平見表1；正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 正交因素水平表

2.2 水提供試品溶液的制備

將處方中的藥材粉碎成粗粉，按比例稱取適量，分別按表1 因素水平進行L9(34) 正交試驗。煎煮液用紗布濾過，合并，濃縮至1000mL，采用0.45μm 微孔濾膜過濾，冷卻置于冰箱，保存備用。

2.3 總酚含量測定

2.3.1 磷鉬鎢酸溶液的制備

鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g，加水700mL 溶解，加鹽酸100mL 和磷酸50mL，加熱回流10h，冷卻，然后再添加硫酸鋰150g，50mL水和0.2mL 溴，煮沸以除去殘留的溴(約15min)，冷卻，用水稀釋至1000mL，過濾即得(溶液應為黃色，如果變為綠色，則加0.2mL溴并煮沸以除去多余的溴)。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取50.2mg 沒食子酸對照品，將其置于50mL 棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，然后精密量取5mL，置于100mL 棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，充分振搖即得(每mL中含0.0504mg沒食子酸)。

2.3.3 供試品溶液的制備

分別精密移取以上提取試驗后合并溶液稀釋至1000mL 后的煎煮液，采用0.45μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 標準曲線的制備

精 密 量 取“2.3.2”項 下 對 照 品 溶 液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，并將其分別置于25mL 的棕色量瓶中，各加入1mL 的磷鉬鎢酸溶液，然后再分別加入水11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min(以相應的試劑為空白)，照紫外—可見分光光度法(《中國藥典》2015 版四部通則0401)，在760 nm 波長下測量吸光度(A)，以溶液濃度(C)(μg)對吸光度(A)進行線形回歸，得線形回歸方程：C =270.872 A-8.286(r =0.9996)，線形范圍：25.1～200.8 μg 時線性關系良好。

2.3.5 樣品的測定

精密量取1mL 的供試品溶液，置于25mL 的棕色量瓶中，并按標準曲線項下方法測定，用外標法計算總多酚含量(以沒食子酸計)，結果見表2。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

表4 驗證試驗結果

2.4 收膏率的測定

分別精密移取以上稀釋至1000mL 提取試驗后合并溶液的二十分之一，將其置于干燥恒重的蒸發皿中，沸水浴上蒸干后，照《中國藥典》2015 版四部通則2201 浸出物測定法，在105℃下干燥3h，取出至干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定，計算收膏率。

2.5 提取工藝優選

由表2 極差分析可知，正交試驗中考察因素的影響為：B 提取次數的影響＞A 加水量的影響＞C 提取時間的影響，但是三種因素均無顯著影響。由表3 方差分析結果并結合直觀分析結果，最終確定提取工藝為A3B3C2，即加水量為12、10、10 倍量，提取3 次，提取時間分別為45、45、45min。

2.6 驗證試驗

取1 倍量的處方藥材投料，按照正交試驗結果確定的最佳工藝提取，合并提取液。按“2.3.3”項下制備供試品溶液，測定提取液中總酚的含量和收膏率，結果見表4。從驗證實驗結果可以看出，3 次平行試驗的總多酚提取率可以達到最高提取工藝的97.75%，而收膏率可以達到最高提取工藝的98.07%，說明提取時相關指標提取較穩定。結果表明，該提取方法具有良好的重現性，工藝條件穩定、合理、可行。

3 討論

復方痛風顆粒是我院通過臨床實踐擬開發的純中藥制劑，通過近年來的臨床觀察證明了其臨床療效和促進尿酸排泄作用而廣泛用于痛風的輔助治療。前期試驗表明白術內脂類成分在復方中未能檢出，嘗試了總黃酮、總三萜皂苷也未能檢出，后面通過多酚檢測發現總多酚含量較高，可作為復方檢測指標，且方中紫蘇梗、枇杷葉中均含有一定量的多酚類化合物，具有抗氧化、抗血小板活性、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗炎、保肝和促進尿酸排泄作用等[1-2]。

綜合評分法優選中藥復方制劑提取工藝是提高中藥制劑質量的重要手段之一。它可以避免單一指標對試驗結果的片面影響，同時還可以更全面、更系統的評價工藝過程，符合中藥復方制劑多組分、多靶點協同作用的特點。鑒于總酚為該制劑有效成分之一，在水提取工藝中采用紫外—可見分光光度法測定提取物中總酚的含量，以此評價工藝的優劣，其為重要指標之一，故權重系數設為0.6；另將收膏率作為大類成分的間接控制指標，考察水提液的得膏量，權重系數設為0.4。目前對復方痛風顆粒劑中總酚酸的提取無相關報道。本研究采用L9(34)正交試驗及綜合評分法建立的水提取工藝操作簡單、重復性好、提取效率高，具有較好的代表性和較高的應用價值，可為后續的工業化生產提供參考。