TPPU 對缺血性腦卒中大鼠AQP4 蛋白的影響

黃攀，張琳蕾，易興陽*，韓釗*

(1.德陽市人民醫院，四川 德陽；2. 溫州醫科大學附屬第三醫院，浙江 溫州)

0 引言

缺血性卒中是嚴重危害人類健康的重大疾病，發病率高，占所有腦卒中的80%左右，溶栓治療和神經保護治療是其兩大主要治療策略。然而，迄今尚無有效的神經保護劑獲得臨床指南推薦[1,2]，但是人類研發有效神經保護劑的探索一直沒有終止。1-三氟甲氧基苯基-3(1-丙酰哌啶-4-基)脲[1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1 -propionyl-piperidin-4-yl)urea，TPPU] 是2012 年由加利福尼亞大學獸醫學院分子生物科學中心Bruce 教授等合成的一種新型sEH 抑制劑[3]，在多種動物模型中顯示其在抗炎和心、腎保護方面均優于傳統sEH 抑制劑[4]。心臟動物模型研究也表明[5]，TPPU可預防心肌梗死后心肌纖維化，具有抗凋亡、抗氧化、保護線粒體等多種功能。但TPPU 在腦缺血后神經保護作用研究少，TPPU 是否具有腦保護作用。因此本試驗主要探討TPPU 對缺血性大鼠水通道蛋白(AQP4)及神經功能的影響。

1 研究方法

1.1 pMCAO 模型的制備

選取250-300g 左右的成年雄性SD 大鼠，采用Longa 線栓法制作。參照本研究小組以往的方法，水合氯醛(350mg/kg，腹腔注射)麻醉后，手術顯微鏡下分離左側頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，充分游離ECA 主干，電凝其遠端并切斷，在殘端剪一小口。采用0.26mm 尼龍魚線頭端去棱角鈍化處理作為線栓，將制備好的尼龍栓線插入ICA 顱內段，當遇到輕微阻力時停止，結扎ECA 根部絲線。尼龍絲線插入深度為19-22mm，造成大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，讓線栓持續阻塞，不拔出線栓，直到實驗結束。假手術組線栓插入深度為10mm，栓線頭端停留于ICA 內。術后將動物置于放有清潔墊料的飼養盒，自由飲水、進食。在這些操作過程中，體溫保持在(37±0.5)°C。局部腦血流量(rCBF) 可借助軟質探針和激光多普勒血流測定儀進行測量。此模型制備操作簡便、副損傷小、梗死灶部位恒定，可以滿足研究的要求。

1.2 實驗分組(每組12 只)

設空白對照組、pMCAO 模型組(pMCAO+DMSO)、pMCAO 模型+TPPU 給藥組。pMCAO 模型+TPPU 給藥組按照TPPU 濃度劑量分為為0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg 共4 個亞組。

1.3 干預方法

空白對照組、假手術組和MCAO 模型組均由腹腔注射相應劑量生理鹽水，pMCAO 模型+ TPPU 給藥組造模后即刻由腹腔注射相應濃度劑量的TPPU 干預。各組在造模后2h，進行Longa 法神經功能缺損評分，判斷模型成功與否。0 分：正常，無神經損傷征象；1 分：動物不能完全伸展右前肢；2 分：動物右側肢體癱瘓，行走時向右側轉圈，出現追尾現象；3 分：行走時向右側跌倒，或動物不能站立或動物打滾；4 分：無自發活動，有意識障礙。神經功能缺損評分1-3 分為造模成功，0 分和4 分為造模不成功予以剔除，在后續實驗中補充剔除的動物，保證每組動物數量。

1.4 觀測指標

pMCAO 后24h 測定下列指標并進行組間統計學比較分析：

1.4.1 神經功能缺損評分

造模后2h、24h(處死動物前)采用Longa 法進行評分。

1.4.2 采用干濕質量法

腦缺血24h 后處死大鼠，快速斷頭取腦，濾紙擦去表面水分，取缺血側半邊大腦，置天平內精密稱取濕質量，然后置110℃電烤箱24h，再迅速測干質量。計算腦含水量用濕重的百分比表示為：( 濕重- 干重)/ 濕重×100%。采用Western-blot 法檢測AQP4 蛋白的表達量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，組間比較采用T 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能缺損評分比較

造模后2h、24h(處死動物前)采用Longa 法進行評分，結果發現與Pmcao+DMSO 組比較，pMCAO+0.5mg/kg 組、pMCAO+2.0mg/kg 組 差 異 無 統 計 學 意 義(P＞0.05)，而pMCAO+1.0mg/kg 組、pMCAO+1.5mg/kg 組差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組腦組織AQP4 蛋白比較

與 Pmcao+DMSO 組 比 較，pMCAO+1.5mg/kg 組、pMCAO+2.0mg/kg 組 差 異 無 統 計 學 意 義(P＞0.05)，而pMCAO+0.5mg/kg 組、pMCAO+1.0mg/kg 組 差 異 有 統 計 學 意義(P＜0.05)。

3 討論

圖1 各組mNSS 評分比較

花生四烯酸(arachidonic acid，AA) 是人體內心腦血管活性物質的前體，其代謝產物與腦血管病的發病密切相關[5]。AA的細胞色素P450(cytochrome P450，CYP) 代謝通路是近年研究的熱點[6]。AA 在CYP 羥化酶作用下生成羥基二十碳四烯 酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETEs)，在CYP 表 氧 化酶作用下生成環氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid，EETs)，EETs 再經過可溶性環氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH) 作用下生成生物活性較弱的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid，DHETs)。HETEs 具有強力的腦血管收縮作用和促動脈粥樣硬化作用。而EETs 具有擴血管、調節離子通道、抗動脈粥樣硬化等多種生物學功能，對心腦血管具有保護作用。我們近期臨床研究發現，AA 的CYP 代謝通路代謝產物(EETs 和HETEs) 水平與急性缺血性卒中后神經功能惡化密切相關[7,8]，提示它們在腦缺血性損傷中可能發揮重要作用。

血腦屏障(BBB) 的破壞是缺血性卒中的重要病理機制。星型膠質細胞參與對BBB 完整性的維持障礙。AQP4 主要分布于星型膠質細胞足突，是介導水進入腦組織的最主要蛋白。腦缺血損傷后，AQP4 表達升高，水通道開放，大量水分子進入細胞內形成細胞內水腫，引起血腦屏障破壞。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK 信號通路參與對水通道蛋白4 的調控。近年研究表明，細胞凋亡在腦缺血中可能起主導作用，腦缺血損傷后缺血半暗帶產生的主要病理生理機制之一是細胞凋亡，線粒體結構和功能改變在細胞凋亡中起關鍵作用[9]。腦缺血后NCU 和BBB 損傷的線粒體細胞凋亡信號通路是目前關注的熱點。

本研究結果表明，不同劑量的TPPU 對缺血性腦卒中神經血管單元具有保護作用，調控水通道蛋白的表達進而影響血腦屏障進而發揮保護神經血管單元是其可能機制之一。

圖2 各組AQP4 蛋白比較