云南省嬰兒期不同民族高非結合性膽紅素血癥UGT1A1基因多態性研究

奎莉越 王明英 周百靈 李莉 賀曉莉 世淑蘭 沈茹

非結合型膽紅素血癥包括Gilbert 綜合征（Gilbert syndrome，GS）和Crigler-Najjiar 綜合征（Crigler-Najjar syndrome，CNS）等，是由于編碼膽紅素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（Uridine diphosphateglucuronosyl transferase，UGTs）的UGT1A1基因發生突變或變異，導致酶活性部分或完全喪失，造成膽紅素升高[1-2]。患兒多在新生期出現黃疸，也可在嬰兒期即發生肝硬化、肝衰竭，膽紅素腦病等后遺癥，重者出生數天或數周死亡，嚴重危害嬰兒的健康[3-4]。國內外的研究已發現該病有明顯的遺傳異質性，已發現有40多個UGT1A1基因突變與該病相關，并且突變譜存在明顯的地區和人群差異[5-8]。云南人群中UGT1A1基因突變譜目前還不清楚，導致該病的診斷、治療和遺傳咨詢困難。雖然國內有UGT1A1基因的相關研究，但不同民族中可能有不同的突變類型分布，且長期工作經驗發現一些病例尚不能用已知的突變類型解釋[9]。本文將探討UGT1A1基因突變與云南兒童GS和CNS 的關系，為臨床診斷、治療、遺傳咨詢提供參考，報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

收集怒江、保山、臨滄、迪慶云南邊界地區2018年1月至2019年11月就診于本院新生兒科及消化內科門診確診的GS和CNS 患兒67例（觀察組，基因檢測均陽性），并選取同期健康體檢嬰兒67例作為對照組。納入標準：①生長發育良好；②新生兒期黃疸至1月未完全消退；③肝功能檢查結果為高非結合膽紅素血癥，即總膽紅素＞17.1 μmol/L，非結合膽紅素所占比值大于80%，經低熱量試驗、苯巴比妥試驗、基因檢測和（或）肝穿刺病理組織學檢查符合GS 或CNS；④均無親緣關系。排除標準：①急慢性肝炎患兒；②結合膽紅素（Conjugated bilirubin，CB）＞非結合膽紅素（Unconjugated bilirubin，UCB）者；③貧血、未做網織紅細胞（Reticulocytes，Ret）或Ret＞5%者；④谷草轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）、丙轉氨酶（Alanine transaminase，ALT）異常者；⑤出生窒息者；⑥早產兒（＜37 W）或出生低體重兒（＜2 500 g）。本研究經本院倫理委員會審核通過，患兒家屬均對本研究知情，自愿簽署知情同意書。

1.2 資料收集

記錄患兒的性別、年齡、民族、喂養史、肝功能情況，常規體檢及血常規、Ret 計數等。

1.3 基因突變檢測

抽取受試者靜脈血2 mL，采用外周血樣本DNA 提取，采用PCR 方法獲取UGT1A1基因，針對exon1、exon2、exon3、exon4、exon5 五個目的基因區段進行PCR 擴增和DNA 直接測序，確定基因突變和變異；分析氨基酸的改變。①樣本DNA 提取：嚴格按血液基因組DNA 抽提試劑盒操作提取基因組DNA；②引物的設計，見表1；③PCR 擴增體系：擴增反應總體積為20 μL，6×Buffer 緩沖液5 μL，Taq 酶（5 U/L）1 μL，dNTP 5 μL，引物各2 μL，模板5 μL，加無菌去離子水至25 μL；反應條件94℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，循環35次；72℃10 min；④PCR 產物純化后在用AB-3500型測序儀進行直接測序；⑤測序圖采用BioEdit 基因閱讀軟件讀圖并人工核對，和基因庫中的標準序列NG_009254.1和已報道的SNP位點進行比對，初步判定變異位點，對變異所在的序列重復PCR 并反向測序加以證實；⑥測序結果用Chromos 基因閱讀軟件判斷，用Mutation Surveyor4.0 軟件分析突變位點，用HGMD 數據庫查詢。

1.4 觀察指標

①對比兩組臨床資料。②比較兩組UGT1A1基因突變位點基因型與等位基因頻率分布。③分析UGT1A1基因突變與非溶血性非結合型高膽紅素血癥的相關性。④比較分析性別、民族與UGT1A1基因變異譜的關系。

表1 引物設計Table1 Primer design

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計進行數據處理，計量資料以（）表示、兩組間比較t檢驗，計數資料用n（%）表示、行χ2檢驗，采用Spearman 進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、胎齡、出生體重、性別、血紅蛋白、白細胞計數、喂養方式、民族、C反應蛋白等資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。具有可比性。見表2。

表2 兩組臨床資料比較Table2 Comparison of clinical data between the 2 groups

2.2 兩組UGT1A1基因突變位點基因型與等位基因頻率分布比較

行UGTlAl全外顯子測序、HGMD 數據庫查詢和Alamut 功能軟件預測，發現3個與非結合性高膽紅素血癥致病相關的突變位點，分別是：1 號外顯子c.211G＞A；5 號外顯子c.1456T＞G；3 號外顯子c.1061C＞T；兩組突變位點基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），具有人群代表性；觀察組c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T位點突變率高于對照組（P＜0.05），組間基因型頻率和等位基因頻率比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 UGT1A1基因突變位點基因型與等位基因頻率分布[n（%）]Table3 Genotype and allele frequency distribution of UGT1A1 mutation site[n（%）]

2.3 UGT1A1基因突變與非溶血性非結合型高膽紅素血癥的相關性分析

采用Spearman 進行相關性分析，c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T 雜合與純合突變均與非溶血性非結合型高膽紅素血癥呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 UGT1A1基因突變與非溶血性非結合型高膽紅素血癥的相關性Table4 Correlation between UGT1A1 gene mutation and non-hemolytic non-binding hyperbilirubinemia

2.4 性別、民族與UGT1A1基因變異譜的關系比較

不同性別、不同民族患兒UGT1A1基因各位點基因型分布比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；漢族患兒c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T 雜合突變型均高于少數民族患兒，漢族患兒c.1456T＞G 純合突變型頻率低于少數民族患兒（P＜0.05）。見表5。

表5 性別、民族與UGT1A1基因變異譜的關系比較[n（%）]Table5 Comparative analysis of the relationship between gender，ethnicity，and UGT1A1 gene mutation profile[n（%）]

3 討論

GS為遺傳性非溶血性黃疸中常見的疾病，常被誤診為肝炎等疾病；CNS-II 表現為中重度膽紅素血癥，其膽紅素水平可在苯巴比妥治療后恢復正常或下降，但黃疸長期持續存在并持續加重，進而發生肝硬化、肝功能衰竭；CNS-I為致死性疾病，CNS-I 患兒常在出生后數天到數周內死于膽紅素性腦病[10-11]。

陳偉等[12]報道發現，不明原因非結合性高膽紅素血癥足月新生兒c.211G＞A 突變占比高于生理性黃疸或健康足月新生兒。本研究結果提示UGT1A1基因c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T位點突變可能是GS、CNS 發病的原因。UGT1A1是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）1家族中第一外顯子，對UGT 的活性起決定性作用，UGT1A1基因所編碼的產物為膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（bilirubin UDP glucumnosyltrasferase，B-UGT），可促進非結合膽紅素轉變為結合膽紅素[13-15]。當UGT1A1基因突變，如UGT1A1第1外顯子211位G＞A 雜合突變，導致所編碼的第71位甘氨酸（Gly）變為精氨酸（Arg）；UGT1A1第5 號外顯子1456位T＞G 雜合突變，導致了酪氨酸（Tyr）變為天門冬氨酸（Asp）等，均可使B-UGT 活性降低或缺陷，非結合膽紅素葡萄糖醛酸化障礙，不能排出體外，從而造成體內非結合膽紅素升高，故與GS、CNS有關[16-18]。且本研究進一步分析發現，c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T 雜合與純合突變均與非溶血性非結合型高膽紅素血癥呈正相關，進一步佐證了以上各位點突變與GS、CNS 發病有關，這可為臨床診斷GS、CNS 及從遺傳水平進一步闡述GS、CNS 發病原因提供循證參考。

不同性別患兒UGT1A1基因各位點基因型分布比較相似，說明性別與UGT1A1基因突變無明顯的關系。Abudahab S 等[19]報道顯示，提示UGT1A1基因突變在不同民族中可能有不同的突變類型分布。目前國內關于UGT1A1基因突變在不同民族中的報道鮮見，本研究對此探討結果提示UGT1A1基因c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T復合雜合突變致病主要集中在漢族人群中，c.1456T＞G 純合突變集中體現在少數民族中，具有種族異質性，臨床可據此有選擇性的進行基因檢測，以快速明確不明原因非結合性高膽紅素血癥的原因，為針對性的干預提供參考，但造成種族間差異的詳細機制不清楚，仍有待后續的探討。本研究不足之處在于，云南怒江、保山等地區包括白族、哈尼族等較多少數民族種類，文中統一將其歸為少數民族，尚未闡明具體各個少數民族UGT1A1基因突變譜，且病例數較少是另一不足，需后續擴大樣本量進行深入的探究。

綜上所述，云南地區嬰兒期高非結合性膽紅素血癥發病與UGT1A1基因c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T位點突變有關，c.1456T＞G 純合突變集中體現在少數民族中，c.211G＞A、c.1456T＞G、c.1061C＞T復合雜合突變致病主要集中在漢族人群。