氧化修飾高密度脂蛋白對大鼠顆粒細胞激素分泌的影響及相關機制

馬金平 李紅娟 李艷敏

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種婦科常見的內分泌紊亂疾病，患者主要表現為卵巢多囊樣病變、月經失調、不孕及性激素分泌異常等癥狀[1]。PCOS 的發病機制尚不明確，不同種族、生活習慣及遺傳因素均可能刺激PCOS 發生，有研究發現大部分PCOS 患者身體肥胖，并伴發代謝綜合征[2]。高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一種可轉運膽固醇的脂蛋白，但該蛋白在銅離子、過氧化物酶等物質作用下易形成氧化修飾高密度脂蛋白（oxidative high density lipoprotein，Ox-HDL），促使卵巢顆粒細胞的膽固醇堆積，并導致細胞的內質網不能正常修飾蛋白質[3]。有研究通過動物實驗發現Ox-HDL 可促使小鼠發生內分泌紊亂，對卵巢發育、性激素分泌產生影響，從而導致雌鼠不孕[4]。由于已有研究發現PCOS 患者的血清Ox-HDL 水平異常上升，Ox-HDL 可能與PCOS 的疾病程度密切相關，探討Ox-HDL 水平對卵巢內分泌功能的作用對治療PCOS 有重要價值[5]。目前Ox-HDL 對PCOS 的影響研究較少，本研究分析Ox-HDL 對雌性大鼠卵巢顆粒細胞激素分泌的影響及相關機制，為治療PCOS 提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及大鼠顆粒細胞制備

30 只6 周齡SPF 級SD 雌性大鼠購自河南省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（豫）2005-2001，體重180～220 g，平均體重205±12 g。大鼠自由飲食，室溫控制為（24±2）℃，濕度為（55±5）%。大鼠適應性喂養5天后，采用孕激素拮抗劑米非司酮進行PCOS 大鼠造模：用橄欖油溶解米非司酮，調整濃度為20 mg/mL，隨機選擇25 只雌鼠，每天對大鼠進行1次皮下注射，每次劑量0.2 mL，連續14 d。其余5 只雌鼠正常飼養，作為對照組。PCOS 大鼠標準：①雌鼠未排卵；②陰道涂片發現大鼠陰道有角化細胞。選擇造模成功的15 只雌鼠，分為模型組，低劑量組及高劑量組，每組5 只。采用生理鹽水溶解Ox-HDL，調整為2種濃度，分別為200 μmol/L，400 μmol/L。對照組及模型組大鼠尾靜脈注射注射0.05 mL 生理鹽水，連續14天。低劑量組每天尾靜脈注射0.05 mL Ox-HDL溶液（200 μmol/L），高劑量組，每天尾靜脈注射0.05 mL Ox-HDL 溶液（400 μmol/L），連續14天。經脫頸椎處死大鼠，在無菌超凈臺取出側卵巢，移入含預冷PBS 的培養皿中，清洗后刺破卵巢成熟卵泡，收集含有顆粒細胞的卵泡液，經200 目細胞篩濾后，以1 200 rmp/min 轉速離心6 min，棄上清后采用DMEM 培養液重懸細胞，密度為5×105/mL，置于37℃、5%CO2條件培養。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；孕馬血清促性腺激素購自上海博升生物科技有限公司；RIPA 裂解液購自上海鈺博生物科技有限公司；細胞周期試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；MTT 試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司；ELISA 試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司；流式細胞儀購自德國Partec 公司；酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司。

1.3 ELISA 實驗檢測大鼠血清孕激素和雌激素分泌水平

按照ELISA 試劑盒說明書操作然后在492 nm用酶標儀檢測各孔OD 值。

1.4 Ox-HDL 對PCOS 卵巢病理形態學觀察

采用4%多聚甲醛固定卵巢樣本24 h，經清水清洗后采用梯度酒精脫水，采用蘇木精染液進行染色，染色時間控制為4 min 左右，經1%鹽酸分化后，通過蒸餾水清洗，直至細胞核變藍，然后經伊紅染液浸潤15 min 后經梯度酒精清洗5 min，通過二甲苯透明后進行蓋片及封片。

1.5 Hoechest33258 凋亡染色實驗

將卵巢顆粒細胞種植于12 孔板中，密度為每孔1×105個，置于37℃、5%CO2條件培養。孵育48 h后，采用甲醇固定細胞5 min，然后每孔加入Hoechest33258 溶液避光6 min，然后采用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 RT-PCR檢測顆粒細胞凋亡基因以及激素相關基因表達水平

各組顆粒細胞經相應處理24 h 后經TRIzol 裂解液提取總RNA，采用Nanodrop 分光光度法檢測RNA 質量，按照反轉錄方法合成cDNA[6]，按照Prime6.0 軟件設計引物，Bcl-2基因引物：上游：5′-CTGCACTGCACGTCTGCAC-3′，下游：5′-CGTCACTGCAGTGCTCA-3′；Bax基因引物：上游：5′-CTGCTCACTCACTGCACTC-3′，下游：5′-TCGACTGCACTCCTAC-3′；FSHR基因引物：上游：5′-CGTGCACTGCATGCCATC-3′，下游：5′-CTAACTGCGTCACTC-3′；StAR基因引物：上游：5′-TCGACTCATCACTGCACTC-3v，下游：5′-CTGACTGCATGCACTGC-3′。通過PCR 方法擴增目的基因[7]，以GAPDH基因為內參，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。

1.7 Western blot 檢測顆粒細胞凋亡蛋白以及激素相關蛋白水平

各組顆粒細胞經相應處理24 h 后，通過RIPA裂解液提取總蛋白，并采用BCA 法檢測蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白[8]，采用濕轉法將分離的蛋白電轉至PVDF 膜，經含5%脫脂奶粉的封閉液孵育1 h 后，分別加稀釋的Bcl-2、StAR、FSHR、StAR 蛋白單抗，4℃搖床過夜后，加入HRP 標記的二抗孵育1.5 h，采用ECL 試劑顯影，拍照后采用ImageJ 軟件分析目的條帶灰度值。

1.8 統計學分析

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析。計量資料均以（）表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ox-HDL 對PCOS 大鼠血清雌激素及孕酮分泌的影響

本研究發現PCOS 大鼠在Ox-HDL 作用后，雌激素及孕酮水平均下降，高劑量組的雌激素及孕酮均顯著低于其它各組差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度Ox-HDL 對PCOS 大鼠血清雌激素及孕酮分泌的影響Figure1 Effects of different concentrations of Ox-HDL on estrogen and progesterone secretion in rat ovarian granulosa cells

2.2 Ox-HDL 對PCOS 大鼠卵巢組織形態的影響

本研究經蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色發現正常大鼠卵巢組織黃體和卵泡數量較多，顆粒細胞排列緊密，卵泡膜細胞層數較少。PCOS 大鼠卵巢體積變大，顆粒細胞排列疏松，PCOS 大鼠給予高劑量Ox-HDL 后，囊腫卵泡進一步增多，顆粒細胞排列較為疏松，大鼠卵巢病理癥狀有一定加劇。見圖2。

圖2 不同濃度Ox-HDL 對PCOS 大鼠卵巢形態的影響（HE，×40）Figure2 Effects of different concentrations of Ox-HDL on ovarian morphology in PCOS rats（HE，×40）

2.3 Ox-HDL 對大鼠顆粒細胞凋亡能力的影響

Hoechest33258 凋亡染色檢測發現高劑量組細胞凋亡水平顯著高于其它各組差異有統計學意義（P＜0.05），提示Ox-HDL 可促進大鼠顆粒細胞的凋亡水平。見圖3。

圖3 不同濃度Ox-HDL 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡水平的影響Figure3 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptotic level of ovarian granulosa cells in rats

2.4 Ox-HDL 對大鼠顆粒細胞凋亡及激素分泌相關基因的影響

RT-PCR 實驗發現發現Ox-HDL 可抑制顆粒細胞Bcl-2、FSHR、StAR基因的mRNA 表達水平（P＜0.05）；Ox-HDL 可促進顆粒細胞Bax基因的mRNA表達水平差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 Ox-HDL 對大鼠顆粒細胞凋亡及激素分泌相關蛋白的影響

Western blotting 實驗發現發現Ox-HDL 可抑制顆粒細胞Bcl-2、FSHR、StAR 蛋白表達水平（P＜0.05）；Ox-HDL 可促進顆粒細胞Bax 蛋白表達水平（P＜0.05）。見圖5。

圖4 不同濃度Ox-HDL 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及激素分泌相關基因的影響Figure4 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptosis of ovarian granulosa cells and hormone secretion-related genes in rats

3 討論

PCOS 是臨床發病率較高的婦科疾病，大部分患者糖脂代謝異常，且性激素分泌紊亂[9]。PCOS的發病機制較為復雜，已有研究發現胰島素抵抗及代償性高胰島素血癥是誘發PCOS 發生的重要因素[10]。HDL 是一種有重要生理功能的脂蛋白，其中載脂蛋白A-1 是HDL 的主要組成部分，主要參與機體的膽固醇運載、抗氧化及調節內分泌等代謝活動[11]。HDL 在過氧化物酶、超氧化物陰離子等物質作用下易發生氧化修飾，形成大量的Ox-HDL，對顆粒細胞的生理功能產生影響。Kolesarova A 等[12]研究發現PCOS 大鼠體內的Ox-HDL水平顯著高于健康大鼠，并與PCOS 的疾病程度密切相關。

圖5 不同濃度Ox-HDL 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及激素分泌相關蛋白的影響Figure5 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptosis of ovarian granulosa cells and hormone secretion-related proteins in rats

有研究發現Ox-HDL 可以下調豬卵巢顆粒細胞培養液中孕酮的分泌水平，但未闡明Ox-HDL 通過何種途徑抑制孕酮的合成[13]。本研究結果說明Ox-HDL 不僅可導致大鼠卵巢病理癥狀加劇，同時激活細胞內的凋亡機制，導致巢顆粒細胞數量下降。PCOS 的病理發生機制較為復雜，有研究僅以卵巢顆粒細胞為研究模型分析Ox-HDL 對細胞激素分泌的影響，不足以充分說明Ox-HDL 對PCOS 的作用效果[14]。有研究發現PCOS 患者血清雌激素及孕酮水平與體內的Ox-HDL 水平有一定相關性[15]。本研究通過Western Blotting 實驗證實Ox-HDL 可誘發顆粒細胞發生凋亡。這表明Ox-HDL 可能通過促進顆粒細胞凋亡減少血清雌激素及孕酮水平，由于動物實驗中Ox-HDL 通過靜脈注射進入大鼠血液系統，并不是直接作用于大鼠顆粒細胞，因而需進一步分析Ox-HDL 對顆粒細胞促凋亡的機制。FSHR、StAR是調節顆粒細胞分泌性激素的重要基因，可刺激cAMP/PKA 信號通路激活，從而促進雌激素及孕酮的合成[16]。本研究結果顯示Ox-HDL 可抑制顆粒細胞的FSHR、StAR基因的表達，提示Ox-HDL 可有效抑制顆粒細胞的激素合成。

綜上所述，Ox-HDL 可PCOS 大鼠卵巢病理癥狀加劇，促進顆粒細胞凋亡水平上升，并干擾性激素分泌相關基因的表達，從而對卵巢性激素分泌功能產生危害，為臨床治療PCOS 提供實驗參考。