CircRNA在婦科腫瘤中的研究進展

郝辰珺 李智 陳彥竹 梁偉國 李艷秋★ 黃超友

近年來，隨著分子生物學技術在臨床疾病診斷和生物制品的研發需求的不斷加深，研究者對腫瘤的作用機理、細胞層面、分子水平的變化進行了深入挖掘。CircRNA 是一種非編碼RNA，其發現改變了傳統的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在機體蛋白編碼的認知觀點[1]。CircRNA與傳統的mRNA 最大的區別在于其存在的閉環可抵抗RNA 酶的降解，這個閉環是由RNA 分子的3′和5′端的磷酸基團共價偶聯而成，從而保障了CircRNA分子的穩定性和進化保護[2]。隨著CircRNA分子在不同生物體中不斷發現，研究者對其進行了相應的信息網絡構建，截止目前國際上已經完成了近20萬種不同CircRNA的信息庫，由此進一步證明CircRNA 是生物界廣泛存在的，但是由于CircRNA分子的發現較晚導致目前其對各種細胞的作用機理及作用途徑了解較少。通過CircRNA分子的生物學特征及分類研究發現，CircRNA分子廣泛參與蛋白質的翻譯和表達，同時其還具有miRNA 海綿分子功能以及RNA 連接蛋白（RNA banding protein，RBP）功能[3]。同時大量研究發現，CircRNA 參與了表觀遺傳學的調控，對生殖干細胞定向發育以及胚胎的成熟均起到重要影響[4]。在疾病診斷上目前大量研究證實CircRNA 可以與miRNA 產生復雜的相互作用從而影響腫瘤細胞的發育、轉移及凋亡等[5]。本研究以CircRNA在婦科腫瘤中的變化為研究思路，綜合國內外研究報道，深入總結CircRNA的生物學特征以及其對婦科腫瘤的發生及在診斷中的價值。

1 CircRNA的概述

1.1 CircRNA 簡介

CircRNA是RNA家族中發現的最新成員，屬于非編碼RNA，其主要存在于轉錄的拼接過程中，由單鏈RNA的3′和5′通過共價鍵連接形成穩定的環狀結構，此環狀共價環有效保障了CircRNA對RNA 核酸外切酶高度耐受性特性，因此相比線性RNA 更具有穩定性。

1.2 CircRNA的來源

CircRNA主要來自于蛋白質編碼基因，目前已經在于人類基因轉錄產物、病毒及細菌中[6]。CircRNA 是tRNA和lncRNA 之間的基因間隔子或反轉錄本，其不含有線性RNA的5′和3′ 的poly（A）結構。根據其RNA 序列的來源不同將其分為外顯子CircRNA（ecRNA）、內含子CircRNA（ciRNA）和外顯子-內含子CircRNA 3種，其中外顯子CircRNA 占比最高。除外顯子CircRNA 存在于細胞質中外，其余兩種均存在于細胞核中，3種CircRNA在細胞中的結合位點均為2′-5′磷酸二酯鍵[7]。外顯子CircRNA 除具有miRNA 海綿作用外，還起到RNA 連接蛋白RBP 作用，以調控RNA的選擇性拼接、運輸及翻譯，從而調控細胞增殖、分化及凋亡等生理過程，內含子CircRNA和外顯子-內含子CircRNA 主要參與調整基因轉錄過程[8]。

1.3 CircRNA的特征及生物學功能

CircRNA 是近年來新發現的非編碼RNA，研究者對其生物學特征的研究主要通過與線性RNA 對比而獲得，目前對CircRNA的分子學特征總結主要包括：①CircRNA 主要產生于外顯子，且主要在細胞質中表達，少量參與細胞核中表達的主要為內含子CircRNA 或其片段；②外顯子CircRNA 可參與內生非編碼RNA的表達調控，其對RNA 轉錄前后的變化起到重要調節作用；③CircRNA 可以與miRNA 相互作用從而調節目標蛋白表達；④CircRNA 具有對RNA 核酸外切酶高度耐受的共價閉環，從而保障了其結構功能的穩定性，這種性質對物種進化過程中起到重要保護作用，這種保護作用間接決定了組織特異性；⑤CircRNA 通常被發現存在于細胞外液（唾液、血液及尿液等）中，且其表達水平是線性RNA的十倍以上[9-11]。CircRNA的上述特征保障了其具有穩定的生物學特征，因此有研究發現多數物種中的CircRNA的半衰期比線性RNA 長近10 h 左右。

基于CircRNA的分子特征，研究者發現了CircRNA 許多潛在的生物學功能，主要包括：①CircRNA 起到miRNA 海綿分子功能。Hansen等[12-13]研究發現CircRNA 含有多個可以與miRNA-138 連接的位點，同時有研究也進一步證實了小腦變異蛋白（CDR1）的反義鏈CircRNA（CDR1as/CiRS-7）存在人和鼠的腦組織中，CiRS-7（circular RNA sponge for miR-7）含有73個miR-7 結合位點，當其與miR-7 結合后可以抑制miR-7 的生物學功能，從而激活miR-7 的下游基因。Thomas B H等[14]研究發現SRY-CircRNA（SRY-9）可以作為miR-138 的分子海綿，而SRY-9 是小鼠Y 染色體上決定性別的基因，因此生物體中CircRNA 作為miRNA的分子海綿可能性較為普遍。同時研究者們[15]還發現絕大多數CircRNA 均可作為miRNAs的分子海綿，就如miRNA 作為mRNA 一樣。②CircRNA 起到RBP 功能，RBP 主要通過對RNA轉錄后調控影響細胞代謝過程（細胞增殖、分化、凋亡及衰老等），如RNA 連接蛋白circ-Foxo3 可通過與細胞蛋白依賴性蛋白激酶2（cyclin-dependent kinases，CKD2）相互作用以抑制細胞周期維持在G1/S 階段[16]。由CircRNA 海綿分子通過與精氨酸蛋白（AGOP）、RNA-QKI MBL 蛋白、RNA 聚合酶Ⅱ（polⅡ）及真核啟動子4A-Ⅲ組成的RNA 蛋白復合體（RNA- protein complexes，RPCs）起到了RBP 作用，并可以與線性RNAs 結合發揮轉錄后調控功能[17]。但是，目前對CircRNA 連接蛋白調控RNA 轉錄機理尚不清楚，但是可以初步確認cricRNA 調控基因轉錄過程主要發生于細胞核中，而其起到RNA 海綿分子作用主要發生在細胞質中。③CircRNA 可參與蛋白編碼過程。CircRNA 屬于非編碼RNA的一條鏈，當其被插入到細胞內核糖體結合位點（IRES）時，就會產生與線性RNA 不同的蛋白編碼轉錄，之后真核細胞核糖體中40s 亞基與含有IRES 的CircRNA 發生病翻譯[18]。截止目前僅發現病毒CircRNA 具備這種可編碼翻譯蛋白的功能，如HBV 的衛星病毒HDV，同時這種病毒CircRNA在真核細胞中的翻譯機理尚不清楚[19]。④CircRNA 協同miRNA 參與機體不同器官細胞的生理功能調節。Chen 等[20]研究中發現進行體外受精治療期間，CircRNA水平（circ103827，circ104816）與女性高質量胚胎數呈現負相關，Dong 等[21]研究發現CircRNA水平與精子的運動及受精也具有相關性。除上述生物學功能外，CircRNA水平也與相關疾病有一定相關性，Zhang 等[22]發現CircRNA101222 表達水平在子癲前期（PE）女性與正常女性之間存在顯著差異。同時，Qian等[23]發現PE女性和早產女性胎盤組織中有3種CircRNA 表達水平存在顯著差異。

1.4 CircRNA在腫瘤發生中的作用機理

隨著CircRNA的深入研究，研究者發現CircRNA的水平變化不僅對機體相關生理功能調節作用，同樣對腫瘤的發生及起到重要影響。大量的研究證實了CircRNA可參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及凋亡。Ma 等[24]研究發現CircRNA-000284 可以與miR-506 作用調節宮頸癌細胞的增殖及侵襲，Xing 等[25]發現CircRNA 可通過調節AKT/mTOR 信號路徑影響腫瘤細胞增殖及轉移。Liu 等[26]發現Circ-ZFR 可以通過調節PTEN和mir-130a/mir-107 促進腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞擴增，Wang 等[27]發現has-Circ-0014717 可以通過調節p16 的表達影響腫瘤細胞周期。綜合近年來研究可知，CircRNA 主要通過調節腫瘤細胞生長過程中相關信號通路途徑調節促進和抑制腫瘤的變化，但是其如何作用信號通路中特定蛋白的機理目前仍需要深入研究。

1.5 CircRNA的臨床檢測

隨著近年來深入研究，研究者發現CircRNA 是一種普遍存在nRNA，其參與細胞中各種不同基因的表達調控，但是目前對其的研究較少且其潛在的一些功能仍未被揭露。傳統的CircRNA 檢測主要通過CircSeq 技術，這種方法對于低豐度CircRNA的檢測有效率較低，同時對區別反向剪接產生的CircRNA和細胞中本身存在的CircRNA 功能較差，隨著生物學信息技術的不斷改進高通量測序技術有效的改善了RNA-seq 上述缺陷。基于高通量測序方法，目前CircRNA的測序工具也相應增多如Mapsplice、CIRI 及CIRCexporer 等。除此之外，為便于有效探知CircRNA的功能，目前全球已建立了關于CircRNA的基因組和序列數據庫（如www.circbase.org）中包含了150 000個CircRNA的信息[28]。

2 CircRNA在婦科腫瘤疾病的相關性研究進展

婦科腫瘤是目前婦科疾病中對女性健康危害性最大的一類疾病。婦科腫瘤種類較多，包括宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌等，據報道，宮頸癌和卵巢癌的致死率及發病率最高。

2.1 CircRNA與宮頸癌

Abdelmohsen 等[3]通過使用宮頸癌HeLa細胞研究證明CircPABPN1 可以競爭性的連接到HuR上，這樣就可以抑制HuR′s 的連接位點連接到PABPN1 mRNA 上進行翻譯，從而抑制腫瘤細胞擴增。Bachmayr-Heyda 等[29]發現在13種人類組織中CircRNA的整體峰度與腫瘤細胞增值率呈現負相關。除此之外，有研究發現，CDRIas 在宮頸癌組織中的表達水平遠高于癌旁組織，而miR-7與其相反[30]。Lee 等[31]通過對宮頸癌的Hela和C33A細胞研究發現，CDRIas 的超表達可以通過抑制miR-7 的活力而增加FAK（粘著斑激酶，miR-7 的靶標）的表達，FAK 的超表達可促進宮頸癌細胞的擴增、侵襲及遷移，此結果進一步證實CDRIas與miR-7 在宮頸癌的調節中具有相關性。因此建立基于CDR1as 的檢測方法對宮頸癌的早期診斷具有重要作用，除此之外以CDR1as 進行分子靶標進行靶向治療潛力巨大。

2.2 CircRNA與卵巢癌

卵巢癌，目前婦科腫瘤中致死率最高的疾病，其不僅影響卵巢部位卵母細胞的正常發育，同時對卵巢激素分泌也造成很大影響。Zhou 等[32]研究發現，當mRNA 上調或CircRNA 下調時，與其相關的NFkB、PI3k/AKT和TGF（這兩個含有多種miR-24/let-7 結合位點）就會在轉移癌中被上調。此結果說明CircRNA與mRNA在卵巢癌的發生中具有相關性，并且可以通過與卵巢細胞上miR-24/let-7結合位點結合競爭性抑制miRNA的線性剪切和海綿功能，調節轉移-誘發基因的表達，從而有利于卵巢癌的轉移。因此以NFkB、PI3k/AKT和TGF作為靶點既可以對卵巢癌的發生及進展的監測具有重要的指導作用。

2.3 CircRNA與乳腺癌

乳腺癌同樣是困擾女性健康的重要疾病。有研究發現CDR1as可以起到的miR-7的海綿分子作用，從而可以反向調節miR-7 活性并降低其對ECF，IRS-1，IRS-2，ak1，Raf1，ACK1和PIK3CD 的抑制作用，從而反過來促進包括乳腺癌在內的腫瘤的發展，當miR-671 連接到CDR1as 上，由AGO介導的分裂就會被啟動從而降低CDR1as 的表達水平，從而減弱CDR1as 的表達，間接調整miR-7的活性水平[33]。miR-7 的表達水平主要被其上游基因HOXD10 正向調節，其低表達水平可以提升癌癥的侵襲性能，當PAK1 水平上升、miR-7 或HOXD10 水平下降時，乳腺癌細胞的侵襲力就會增強[34]。發現miR-7 還可靶向REGγ 抑制乳腺癌小的擴增，同時可促進乳腺癌細胞凋亡[35]。因此，miR-7 的表達水平與癌癥的上皮分化密切關聯：表達水平越低，轉移潛能越弱。

Karla 等[36]發現miR-7 可以抑制p21 激酶的表達（PAK1），這種酶在多種腫瘤中水平均呈現上調，同時有研究發現miR-7 在哺乳動物乳腺癌組織中低水平表達，且其表達水平與癌細胞的轉移能力能負相關性。Tang 等[37]發現作為miR-7的海綿分子，CDR1as 可以反向調節其活性并降低其對ECF，IRS-1，IRS-2，ak1，Raf1，ACK1和PIK3CD 的抑制作用，從而反過來促進乳腺癌的惡化。

2.4 CircRNA與子宮內膜癌

在其他婦科腫瘤研究中，Yang 等[38]發現Circ-ITCH可以競爭性的連接到miR-17和miR-224，從而影響p21和PTEN的不同表達，PTEN的突變或缺失可使其酶活性失活，然后PTEN失去抑制細胞增殖的能力，PTEN位于10 號染色體上，其可以參與磷酸酶和肌張力蛋白的表達，磷酸酶和肌張力蛋白同源物是一種具有磷酸酶活性的癌癥抑制物，因為它可以抑制分裂、增殖、侵襲、遷移及并加速癌細胞的凋亡。因此，當PTEN的突變或缺失可使其酶活性失活，細胞傾向于惡性腫瘤，可能會引起子宮內膜癌。同時Chen 等[39]研究發現，正常人子宮內膜癌組織中CircRNAs 表達水平較低，因此CircRNAs 水平的變化對子宮內膜癌的發生具有一定的診斷價值。

3 CircRNA在婦科腫瘤疾病的診療中面臨的挑戰

綜合上述研究分析可知，CircRNA已經越來越備受科學界所關注，其參與機體細胞分子生物學調控的機理也不斷被揭露，然而這些研究都是處于初步研究階段。CircRNA在生物體內廣泛存在，但是各種潛在CircRNA分子信息庫的構建目前還待完成，同時這些CircRNA在不同疾病的信號通路調控路徑還需要進一步研究。通過對婦科腫瘤疾病相關CircRNA分子調控的近些年研究總結可知，CircRNA在婦科腫瘤疾病的診斷、病程發展判斷和靶向分子治療藥物的研究具有重要指導意義。但是，在不同類型婦科腫瘤發生相關CircRNA 之間的關聯性研究方面較少，仍需要進一步深入挖掘。同時，不同CircRNA在調節腫瘤的發生及抑制過程中角色研究目前還不清楚。特別是在癌癥不同階段，CircRNA分子之間、CircRNA分子與miRNA分子之間復雜協作機理的研究均是未來科學認知的挑戰。

4 展望

婦科惡性腫瘤是婦科疾病中對患者傷害最大的疾病，目前對惡性腫瘤的治療無特效的藥物，主要通過早期診斷及早期治療方式改善預后。為了有效提升早期診斷準確性，分子生物學診斷技術在婦科腫瘤疾病的診療中越來越收到關注。CircRNA 是非編碼RNA家族后起之秀，越來越多的研究證實其在生物體中種類豐富多樣，結構較為穩定，在細胞或組織中特定表達。因此，基于不同CircRNA分子建立調控網絡，為后期婦科腫瘤在疾病預防及治療藥物的研發提供了重要的指導思路。除此之外，CircRNA分子在臨床疾病診斷中新型快速檢測技術的研發同樣是未來發展的一種趨勢。